陳文炳，繆婷玉，彭 娟，邵碧英，陳 彬，江樹(shù)勛，張志燈

（福建出入檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350003）

基于16S rRNA基因DNA條形碼鑒定美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻

陳文炳，繆婷玉，彭 娟，邵碧英，陳 彬，江樹(shù)勛，張志燈

（福建出入檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350003）

為滿足鰻魚(yú)養(yǎng)殖、加工、貿(mào)易企業(yè)及執(zhí)法部門的需求，建立我國(guó)主要養(yǎng)殖鰻魚(yú)美洲鰻（Anguilla rostrata）、歐洲鰻（Anguilla anguilla）、日本鰻（Anguilla japonica）的物種DNA條形碼鑒定方法。以擴(kuò)增16S rRNA基因的通用引物擴(kuò)增美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻的16S rRNA基因片段，各獲得1 條16S rDNA片段，測(cè)序結(jié)果表明，前二者的長(zhǎng)度均為638 bp、日本鰻的長(zhǎng)度為640 bp，為了使物種鑒定方法更簡(jiǎn)便，結(jié)果更準(zhǔn)確，從各自片段中截取具有物種特異序列的片段（243 bp），作為3 種鰻魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，設(shè)計(jì)兩端堿基數(shù)分別為22 bp與23 bp的正向與反向引物，建立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-DNA條形碼檢測(cè)方法。3年來(lái)的應(yīng)用結(jié)果表明：建立的美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻3 種鰻魚(yú)的DNA條形碼鑒定方法，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可應(yīng)用于3 種鰻魚(yú)的物種鑒定。

美洲鰻；歐洲鰻；日本鰻；16S rRNA基因；DNA條形碼；鑒定

我國(guó)東部沿海省份，福建、浙江、山東、江蘇、廣東等是鰻魚(yú)養(yǎng)殖與加工出口大省，主要產(chǎn)品有3 種鰻魚(yú)，即美洲鰻（Anguilla rostrata）、歐洲鰻（Anguilla anguilla）、日本鰻（Anguilla japonica）。2015年烤鰻與活鰻出口量達(dá)4萬(wàn) t，貨值達(dá)10億 美元，主要出口國(guó)有日本、美國(guó)、俄羅斯、德國(guó)、韓國(guó)等。由于鰻魚(yú)加工品如烤鰻、蒲燒或制成其他形態(tài)熟食后，以及進(jìn)口鰻苗體積細(xì)小，難以從形態(tài)上辨別其種類。一方面不同種類的鰻魚(yú)產(chǎn)品與鰻苗價(jià)格也不同，另一方面，歐洲鰻被自然保護(hù)國(guó)際聯(lián)盟組織列為極度瀕危物種，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》秘書(shū)處于2009年3月13日宣布，174個(gè)《公約》的締約國(guó)將對(duì)歐洲鰻實(shí)施新的監(jiān)管措施[1-2]，之后所有的歐洲鰻國(guó)際貿(mào)易都需要獲得進(jìn)出口許可證。進(jìn)口國(guó)則需要確保所有進(jìn)口的歐洲鰻都伴隨有出口許可證，我國(guó)鰻魚(yú)產(chǎn)品出口日本，被要求提供檢驗(yàn)檢疫部門出具的鰻魚(yú)物種鑒定報(bào)告，如果產(chǎn)品物種屬于歐洲鰻，又未能提供出口許可證，將被強(qiáng)行銷毀處理。為了維護(hù)企業(yè)與消費(fèi)者利益以及正常市場(chǎng)秩序，避免貿(mào)易壁壘，應(yīng)企業(yè)與執(zhí)法部門要求，建立主要進(jìn)出口鰻魚(yú)種類的精確鑒定方法，對(duì)我國(guó)鰻魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)與加工出口外貿(mào)易具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)在食品中魚(yú)類物種成分的鑒別已有不少研究與應(yīng)用[3-7]，但在鰻魚(yú)中的應(yīng)用主要是基于PCR的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA遺傳多樣性分析與物種鑒別的初步研究[8-12]，應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐，缺乏穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。DNA條形碼是生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。最早由加拿大生物學(xué)家Hebert研究[13-14]發(fā)現(xiàn)利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因一段長(zhǎng)度為648 bp的片段，能夠在DNA水平上成功的區(qū)分物種，認(rèn)為利用COⅠ基因從分子演化的角度，將提供一種快速、簡(jiǎn)便、可信的分類方法，且命名為DNA條形碼技術(shù)。近年來(lái)，隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，除了COⅠ基因DNA序列作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼應(yīng)用于物種鑒別[13-15]外，作為重要條形碼的線粒體16S rRNA、COⅡ等基因的DNA序列，也越來(lái)越多地被應(yīng)用于物種鑒別和遺傳多樣性分析[16-23]，國(guó)內(nèi)有關(guān)于鰻魚(yú)線粒體DNA的COⅠ與COⅡ基因序列分析及其系統(tǒng)分類的研究[24-26]報(bào)道。國(guó)外有研究應(yīng)用COⅠ基因序列的DNA條形碼與GenBank中鰻魚(yú)DNA序列比對(duì)，而判定非法貿(mào)易的歐洲鰻物種，但該方法往往存在待測(cè)樣品與GenBank中多個(gè)鰻魚(yú)物種同源率相同，產(chǎn)生難以準(zhǔn)確判斷具體物種的困惑[27-28]。目前國(guó)內(nèi)外尚鮮有利用16S rRNA基因序列作為DNA條形碼進(jìn)行鰻魚(yú)物種鑒定的研究報(bào)道。本研究基于16S rRNA基因的部分DNA序列分析與比對(duì)，篩選出了標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，建立了日本鰻、美洲鰻、歐洲鰻物種的精確鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鰻魚(yú)樣品

日本鰻（Anguilla japonica）、美洲鰻（Anguilla rostrata）、歐洲鰻（Anguilla anguilla）的蒲燒鰻成品，由福建省三明市華晟食品公司提供，105號(hào)、123號(hào)、223號(hào)待測(cè)鰻魚(yú)樣品系企業(yè)委托實(shí)驗(yàn)室留樣。

1.1.2 試劑

十六烷基三甲基溴化銨 上海博亞生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖英國(guó)Oxoid公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GL212 PRO凝膠成像儀 美國(guó)Carestream公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

16S rRNA基因PCR擴(kuò)增通用引物[20]序列與自主設(shè)計(jì)的DNA條形碼引物見(jiàn)表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鰻魚(yú)16S rDNA的PCR引物與PCR產(chǎn)物Table1 Primer sequences for PCR amplif i cation of 16S rDNA from eel and corresponding PCR products

1.2.2 DNA的提取

1.5 mL離心管中加入約50 mg樣品粉末或鮮樣100 mg，加200 μL TE溶液（pH 8.0），旋渦混勻；加入400 μL裂解液，旋渦混勻；加600 mL Tri-飽和酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），劇烈振蕩，12 000×g離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），劇烈振蕩，12 000×g離心10 min；取上清液，加0.8 倍體積異丙醇，12 000×g離心10 min；取沉淀，加入400 μL NaCl（1 mol/L）于65 ℃溫浴中溶解，再加入5 μL蛋白酶K溶液（20 mg/mL），5 μL Rnase A（10 μg/mL），劇烈振蕩30 s以上，37 ℃溫浴1 h，期間定期晃動(dòng)。加等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），振蕩，12 000 r/min離心15 min，重復(fù)該步驟1～2 次，直到蛋白質(zhì)去除干凈為止。取上清液，加2 倍體積的無(wú)水乙醇，輕微晃動(dòng)，12 000 r/min離心10 min。取沉淀，70%乙醇溶液清洗2 次，干燥，加100 μL TE（pH 8.0）溶解。每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 DNA的濃度與純度測(cè)定

樣品DNA用核酸蛋白分析儀測(cè)定260 nm和280 nm處OD值，分別計(jì)算DNA純度與質(zhì)量濃度，計(jì)算公式如下：DNA純度=OD260nm/OD280nm，比值在1.7～2.0之間較為理想；雙鏈DNA質(zhì)量濃度/（μg/mL）=50×OD260nm值。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系

采用的PCR檢測(cè)體系見(jiàn)表2。每個(gè)樣品反應(yīng)體系設(shè)2個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系設(shè)置空白對(duì)照，用配制反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)用純水代替DNA模板，防止交差污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生。

表2 定性PCR檢測(cè)反應(yīng)體系（25μL）Table2 Reaction system for qualitative PCR detection

1.2.5 PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置

94 ℃預(yù)變性3 min。94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min。4 ℃條件下保存。也可根據(jù)不同的基因擴(kuò)增儀對(duì)PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

用0.5×TBE電泳緩沖液制備2 g/100 mL的瓊脂糖凝膠。將8～10 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與1～2 μL的6×加樣緩沖液（電泳前沿指示劑）混合后，在凝膠板上的孔中點(diǎn)樣。用分子質(zhì)量大小適當(dāng)?shù)腄NA Marker做分子質(zhì)量標(biāo)記。選擇合適的電壓（80～90 V），電泳時(shí)間為50～60 min。用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄與分析。

1.2.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測(cè)序與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托鉑尚（Biosune）生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行克隆、測(cè)序，得到的結(jié)果用DNAMAN V6（中文版）進(jìn)行整理以*.seq格式輸出，然后進(jìn)行同源性比對(duì)與親緣關(guān)系分析，比對(duì)結(jié)果以MASED Document/ DNAMAN1格式輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻魚(yú)的16S rDNA通用引物PCR及其產(chǎn)物序列分析

提取的鰻魚(yú)DNA純度（OD260nm/OD280nm）在1.8～1.9之間，質(zhì)量濃度在500～1 000 ng/μL之間，可用于PCR分析。用表1中的16S rDNA通用引物對(duì)3 種鰻魚(yú)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物電泳圖如圖1所示。PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序結(jié)果獲得3 條16S rDNA序列，其中美洲鰻與歐洲鰻的片段長(zhǎng)度均為638 bp，日本鰻為640 bp，在GenBank中比對(duì)，分別與數(shù)據(jù)庫(kù)中的A. rostrata（KJ564217.1）、A. anguilla（KJ564270.1）、A. japonica（AB278890.1）的同源率均為99%?；? 條序列的同源性比對(duì)部分圖（圖2），排除序列中存在堿基缺失部分與不具差異的區(qū)間，選取具有物種特異性的片段，從250號(hào)堿基截取至492號(hào)堿基（以未出現(xiàn)堿基缺失的日本鰻為準(zhǔn)），長(zhǎng)度為243 bp，作為DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段，選取堿基序列相同片段（下劃黑線部分）為新設(shè)計(jì)引物（16S rDNA-Eel-243，表2），上游引物為250～271號(hào)堿基：CCTGTTCCTCGTGGGGGCTTTT（22 bp），下游引物為470～492號(hào)堿基的反向互補(bǔ)序列ATGGCATAACGAGGGTTTAACTG（23 bp）。由圖2可知，在選定的3 種鰻魚(yú)的特異DNA條形碼片段（250～492號(hào)堿基）主要差別在352～354號(hào)框內(nèi)的3 個(gè)堿基，其中美洲鰻為GTT，歐洲鰻為GGT，日本鰻為AAC。

圖1 3 種鰻魚(yú)部分16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplif i cation results o f partial 16S rRNA gene in 3 species of eel

圖2 3 種鰻魚(yú)16S rRNA部分基因序列比對(duì)（部分圖）Fig.2 Multiple alignment of partial 16S rRNA gene sequences among three eel species

2.2 物種特異性標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列建立及分析

圖3 3 種鰻魚(yú)16S rRNA基因部分DNA片段PCR產(chǎn)物堿基序列（243 bp）Fig.3 DNA sequences (243 bp) of PCR products of partial 16S rRNA gene sequences from 3 eel species

圖4 3 種鰻魚(yú)16S rRNA基因部分片段（243 bp）的DNA條形碼序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of DNA barcode of partial 16S rRNA gene (243 bp) among three eel species

以2.1節(jié)中設(shè)計(jì)的16S rDNA-Eel-243引物（表1），對(duì)3 種鰻魚(yú)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、雙向測(cè)序，各獲得一條長(zhǎng)度為243 bp的DNA片段序列（圖3），從正向引物第1個(gè)堿基C起第103～105號(hào)堿基序列為美洲鰻魚(yú)GTT、歐洲鰻GGT、日本鰻AAC（圖4），該片段具有3 個(gè)鰻魚(yú)物種特異性，可作為物種鑒定的DNA條形碼。種間序列同源性分析表明，美洲鰻與歐洲鰻間的同源率為99%，二者與日本鰻間為96%（圖5）。3 條序列GenBank登錄號(hào)為美洲鰻KX440970、歐洲鰻KX440971、日本鰻KX440972。

圖5 3 種鰻魚(yú)DNA條形碼序列（243 bp）親緣關(guān)系樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of three eel species based on DNA barcode sequence (243 bp)

2.3 3 種鰻魚(yú)樣品物種DNA條形碼鑒定方法建立與應(yīng)用

2.3.1 DNA條形碼鑒定方法建立

1）制樣：取鰻魚(yú)單個(gè)個(gè)體肌肉烘干研磨成粉末，或直接取鮮肉；2）DNA提取：按照1.2.2節(jié)部分操作；3）DNA質(zhì)量檢測(cè)：用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA純度與質(zhì)量濃度，DNA純度（OD260nm/OD280nm）在1.7～2.0，或用凝膠電泳、染色、成像檢測(cè)（凝膠質(zhì)量濃度1 g/100 mL），步驟參照1.2.6節(jié)；4）PCR擴(kuò)增反應(yīng)與測(cè)序：步驟按照1.2.4節(jié)～1.2.7節(jié)。用16S rDNA-Eel-243引物（表1）擴(kuò)增出243 bp的PCR產(chǎn)物，為了獲得完整的243 bp序列，必須進(jìn)行克隆、雙向測(cè)序與接拼。然后將243 bp片段序列，用DNAMANV6軟件輸入，轉(zhuǎn)化成.seq格式，與2.2節(jié)建立的3 種鰻魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼（.seq格式）進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得同源樹(shù)，待測(cè)樣品與哪個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)條形碼100%同源，就可判別為是哪個(gè)物種。

2.3.2 DNA條形碼方法在鰻魚(yú)物種鑒別中的應(yīng)用

圖6 3 種鰻魚(yú)DNA條形碼的PCR產(chǎn)物（243 bp）Fig.6 PCR products of DNA barcode sequences (243 bp) from three eel species

選用實(shí)驗(yàn)室留樣105號(hào)、123號(hào)、223號(hào)待測(cè)鰻魚(yú)樣品，經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增（圖6）、克隆、雙向測(cè)序與序列接拼，獲得的序列（243 bp）分別與3 個(gè)物種鰻魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼進(jìn)行比對(duì)，獲得序列比對(duì)圖與同源樹(shù)見(jiàn)圖7～9，同源樹(shù)圖中可知：105號(hào)、123號(hào)、223號(hào)樣品分別與日本鰻、美洲鰻、歐洲鰻的同源率為100%。因此，判別105號(hào)、123號(hào)、223號(hào)待測(cè)鰻魚(yú)樣品分別為日本鰻、美洲鰻、歐洲鰻。

圖7 105號(hào)樣品DNA條形碼與3 種鰻魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列比對(duì)及同源樹(shù)Fig.7 Multiple sequence alignment of DNA barcodes from partial 16S rRNA genes of sample 105 and three known eel species and phylogenetic tree

圖8 123號(hào)樣品DNA條形碼與3 種鰻魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列比對(duì)及同源樹(shù)Fig.8 Multiple sequences alignment of DNA barcodes from partial 16S rRNA genes sample 123 and three known eel species and phylogenetic tree

本方法2013年10月作為實(shí)驗(yàn)室非標(biāo)方法，應(yīng)用于企業(yè)委托業(yè)務(wù)鰻魚(yú)加工產(chǎn)品（單個(gè)體樣品）與鰻苗個(gè)體的物種檢測(cè)，3年多來(lái)共檢測(cè)樣品171 份，其中判別為美洲鰻的74 份，歐洲鰻的57 份，日本鰻的40 份，結(jié)果未出現(xiàn)差錯(cuò)。

圖9 223號(hào)樣品DNA條形碼與3 種鰻魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列比對(duì)及同源樹(shù)Fig.9 Multiple sequences alignment of DNA barcodes from partial 16S rRNA genes of sample 223 and three known eel species and phylogenetic tree

3 討論與結(jié)論

Hebert最早提出DNA條形碼的定義，且僅限于COⅠ基因序列，種內(nèi)遺傳距離一定要小于種間距離，種間遺傳距離在2%以上，且是種內(nèi)的10 倍以上[11]。DNA條形碼（COⅠ、COⅡ基因序列）應(yīng)用于鰻魚(yú)系統(tǒng)發(fā)育與分類的研究，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)個(gè)體間也存在遺傳距離[23-27]，雖然比種間距離小，但在其他物種存在種內(nèi)與種間距離重疊的現(xiàn)象[23]，即有時(shí)種內(nèi)距離反而大于種間。Vandamme[27]、Stein[28]等應(yīng)用COⅠ基因序列鑒別非法貿(mào)易的瀕危物種歐洲鰻，結(jié)果因存在待測(cè)樣品同時(shí)與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中2個(gè)以上物種序列同源率相同的問(wèn)題，給結(jié)果判定造成困惑，最終只能借助其他數(shù)據(jù)庫(kù)（如BOLD（The Barcode of Life Data System））收錄的DNA序列加以比對(duì)，做出綜合判定?？梢?jiàn)，最理想的物種鑒定DNA條形碼指標(biāo)，應(yīng)該是物種內(nèi)部個(gè)體間遺傳距離為0，而種間保持一定的距離。隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，除了COⅠ基因DNA序列作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼[11-13]外，作為重要條形碼的線粒體16S rRNA、COⅡ等基因的DNA序列，近年也越來(lái)越多地被應(yīng)用于物種鑒別和遺傳多樣性分析[14-21]。理想的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼片段不應(yīng)局限于COⅠ基因序列，只要能有效鑒別物種的DNA片段都可以應(yīng)用，多基因遺傳信息的組合使用，能獲得更理想的物種系統(tǒng)進(jìn)化的分析結(jié)果[30]。

本方法于2013年10月作為實(shí)驗(yàn)室非標(biāo)方法，應(yīng)用于企業(yè)委托業(yè)務(wù)鰻魚(yú)加工產(chǎn)品烤鰻（單個(gè)體樣品）與鰻苗個(gè)體的檢測(cè)，至本文投稿（2016年6月），3年多來(lái)共為相關(guān)企業(yè)出具出口鰻魚(yú)產(chǎn)品與進(jìn)口鰻苗樣品檢測(cè)結(jié)果報(bào)告171 份，結(jié)果未出現(xiàn)差錯(cuò)，未有客戶提出異議，為企業(yè)鰻魚(yú)產(chǎn)品出口與進(jìn)口鰻苗的鰻種鑒定提供了重要技術(shù)支持，該法已經(jīng)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委作為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目立項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后將在檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐中推廣應(yīng)用。但該方法也存在局限性，僅限于以個(gè)體為樣品的檢測(cè)，進(jìn)行美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻的3 種鰻魚(yú)種類的判別。為滿足執(zhí)法與市場(chǎng)需求，將進(jìn)一步擴(kuò)大鰻魚(yú)物種研究范圍，設(shè)計(jì)出更多的引物，從COⅠ、COⅡ、Cyt b等基因中篩選出更理想的DNA條形碼，用于鰻魚(yú)物種精準(zhǔn)鑒定。

本研究應(yīng)用16S rRNA基因的通用引物，通過(guò)鰻魚(yú)16S rRNA基因部分DNA片段的PCR擴(kuò)增與測(cè)序，篩選出具有3 種鰻魚(yú)（美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻）物種特異性DNA片段（243 bp），設(shè)計(jì)了一對(duì)新的引物用于擴(kuò)增該片段，作為具有物種特異性的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，建立了3 種鰻魚(yú)的物種鑒別方法。3 種鰻魚(yú)的物種間關(guān)系為：美洲鰻與歐洲鰻間的同源率為99%，二者與日本鰻間為96%（圖5）。待測(cè)鰻魚(yú)樣品獲得的條形碼與本方法建立的標(biāo)準(zhǔn)條形碼之間的同源率為100%，即遺傳距離為0時(shí)，才能進(jìn)行所屬物種的判斷，不存在待測(cè)樣品同時(shí)與Genbank中多個(gè)物種DNA序列同源率相同的問(wèn)題，是理想的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。

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Identif i cation of Anguilla rostrata, Anguilla anguilla and Anguilla japonica Using DNA Barcoding Based on 16S rRNA Gene

CHEN Wenbing, MIAO Tingyu, PENG Juan, SHAO Biying, CHEN Bin, JIANG Shuxun, ZHANG Zhideng
(Inspection and Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

To meet the demands of enterprises engaged in eel farming, processing and trading and law enforcements, a DNA barcoding method for the identif i cation of three main farmed eel species, Anguilla rostrata, A. Anguilla and A. japonica, was developed. Universal 16S rRNA primers were designed and used to amplify partial 16S rRNA gene fragments of A. rostrata, A. Anguilla and A. japonica and their PCR products were sequenced to be 638, 638 and 640 bp in length, respectively. The specif i c DNA fragment (243 bp) was selected as standard DNA barcode with eel species specif i city to identify eel species conveniently, and a forward primer (22 bp) and a reversed primer (23 bp) were designed and used to establish the PCRDNA barcoding method. The results of the application of the proposed method over the past three years showed that it is convenient, accurate, stable, and useful to identify the three eel species.

A. rostrata; A. Anguilla; A. japonica; 16S rRNA gene; DNA barcode; identif i cation

10.7506/spkx1002-6630-201704046

S917.4；Q78

A

1002-6630（2017）04-0283-07

陳文炳, 繆婷玉, 彭娟, 等. 基于16S rRNA基因DNA條形碼鑒定美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 283-289. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704046. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wenbing, MIAO Tingyu, PENG Juan, et al. Identification of Anguilla rostrata, Anguilla anguilla and Anguilla japonica using DNA barcoding based on 16S rRNA gene[J]. Food Science, 2017, 38(4): 283-289. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704046. http://www.spkx.net.cn

2016-06-27

福建省科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015N0016）

陳文炳（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、食品分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。E-mail：621213wbc@163.com