王 晶，王 耀*，王方雨，鄧瑞廣，胡驍飛，余秋穎，郝俊芳，邢云瑞，侯玉澤

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，畜禽疫病診斷與食品安全檢測(cè)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023）

草甘膦人工抗原的制備及兔源多抗的ELISA鑒定

王 晶1,2，王 耀2,*，王方雨1,*，鄧瑞廣1，胡驍飛1，余秋穎1，郝俊芳1，邢云瑞1,2，侯玉澤2

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，畜禽疫病診斷與食品安全檢測(cè)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023）

采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）法和戊二醛（glutaraldehyde，GA）法，合成了草甘膦（N-(phosphonomethyl) glycine，PMG）人工抗原，通過免疫制備高敏感性、特異性的兔PMG多克隆抗血清并進(jìn)行鑒定。將PMG分別與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯(lián)，合成免疫抗原PMG-BSA和包被抗原PMG-OVA。經(jīng)紫外掃描、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，免疫新西蘭大白兔，制備多抗。利用間接酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法測(cè)定多抗效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定血清的敏感性和特異性。結(jié)果表明，免疫的3 只兔血清效價(jià)均達(dá)1∶104以上，2號(hào)兔多抗效果最好，半數(shù)抑制濃度（IC50）為30.9 μg/mL，且具備良好的特異性。本實(shí)驗(yàn)成功合成了PMG人工抗原，并制得了敏感性高、特異性好的兔多抗，為PMG的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的提供參考。

草甘膦；人工抗原；多抗；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

近年來(lái)草甘膦殘留引起人們的廣泛關(guān)注，目前用于草甘膦殘留檢測(cè)的主要方法為儀器分析方法，包括光譜法[1]、氣相色譜法[2]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、離子色譜法[4-5]、毛細(xì)管電泳法[6]以及流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[7]等，這些方法存在儀器設(shè)備昂貴、操作人員專業(yè)要求高以及樣品前處理程序復(fù)雜等一系列弊端；而針對(duì)草甘膦（N-(phosphonomethyl) glycine，PMG）的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)方法發(fā)展迅速，主要是建立在免疫學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)之上，這些免疫學(xué)檢測(cè)方法由于操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。Clegg等[8]制備了兔抗PMG多克隆抗體，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)PMG，最低檢測(cè)限達(dá)7.6 μg/mL。Lee等[9]利用一個(gè)由雙抗原和DNA膠體金微粒為探針組成的三明治夾心免疫傳感器檢測(cè)PMG，檢測(cè)范圍為0.01～100 μg/mL。González-Martínez等[10]將抗PMG免疫血清與酶標(biāo)PMG以及熒光檢測(cè)相結(jié)合，通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定PMG含量，最低檢測(cè)限達(dá)到21 ng/L。潘熙萍等[11]通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）法制備免疫原和包被原，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫制備多克隆抗體，建立PMG間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，并應(yīng)用于玉米粉和小麥粉中PMG的殘留檢測(cè)。

為了能夠獲得高質(zhì)量的抗體，本實(shí)驗(yàn)利用EDC法和戊二醛（glutaraldehyde，GA）法，將PMG與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，并分別用紫外掃描、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠電泳方法對(duì)免疫原進(jìn)行鑒定，經(jīng)大白兔免疫后獲得針對(duì)PMG的兔源多抗且免疫學(xué)特性良好，本研究所制備的PMG人工抗原可應(yīng)用于ELISA快速檢測(cè)方法的初步建立。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

潔凈級(jí)3 月齡雌性新西蘭大白兔，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

PMG（純度≥98%）、EDC、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國(guó)Thermo Scientific公司；GA 美國(guó)Sigma Aldrich公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國(guó)Pierce公司；羊抗兔酶標(biāo)二抗（goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase，GaRIgGHRP） 華美生物工程有限公司；雙蒸水由動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)室自制；常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 溶液

2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid， MES，0.1 mol/L）緩沖液；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L）；PBST洗液（V（PBS）∶V（Tween20）=2×103∶1）；包被緩沖溶液（0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液）；封閉液（V（PBST）∶V（豬血清）＝20∶1）；TMB顯色液；終止液（2 mol/L H2SO4）。

1.1.4 儀器與設(shè)備

AE260電子天平 德國(guó)Mettler公司；HI9321酸度計(jì)意大利Hanna公司；恒溫磁力攪拌器 上海亞榮儀器廠；Nano Drop 1000微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿(mào)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件 美國(guó)Syngene公司；3K-18高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；550型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；超純水儀 德國(guó)Millipore公司；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成

1.2.1.1 EDC法合成人工抗原

[12-13]合成抗原，利用EDC法進(jìn)行人工抗原的合成，碳二亞胺EDC是一種化學(xué)性質(zhì)很活潑的試劑，能使氨基和羧基間脫水縮合而形成酰胺鍵。使PMG的羧基先與EDC反應(yīng)，生成中間產(chǎn)物，然后再與BSA的氨基反應(yīng)，形成偶聯(lián)產(chǎn)物。合成路線如圖1所示，首先，稱量PMG 10 mg，BSA 15 mg。將PMG用1 mL雙蒸水溶解后得到溶液A，用1.5 mL的0.1 mol/L MES溶解BSA得到溶液B，稱取30 mg的EDC和20 mg的NHS溶于1 mL MES溶液得到溶液C。將溶液C逐滴加入溶液A中反應(yīng)5 min，使PMG得到充分活化，然后加入溶液B中。在室溫條件下，磁力攪拌2 h。在PBS中透析72 h，5 000 r/min離心5 min取上清液，即得免疫抗原PMG-EDC-BSA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。同法制得包被抗原PMG-EDC-OVA。

圖1 免疫原PMG-EDC-BSA合成示意圖Fig.1 Synthesis scheme for immunogen PMG-EDC-BSA

1.2.1.2 GA法合成人工抗原

GA是一種同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基可分別與兩個(gè)氨基化合物的氨基形成Schiff堿（—N＝C—)，在兩個(gè)化合物之間插入一個(gè)五碳橋，合成路線如圖2所示。首先，稱量PMG 15 mg，BSA 12 mg。將PMG用1 mL雙蒸水溶解后得到溶液A，用1.5 mL的PBS溶液溶解BSA得到B溶液。將A溶液逐滴加入B溶液中，然后加入GA 24 μL，室溫避光磁力攪拌3 h。然后加入少量氰基硼氫化鈉粉末，繼續(xù)攪拌20 min后，取出溶液進(jìn)行透析。在PBS中透析72 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液，即得免疫抗原PMG-GA-BSA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄖ频冒豢乖璓MG-GA-OVA。

圖2 免疫原PMG-GA-BSA合成示意圖Fig.2 Synthesis scheme for immunogen PMG-GA-BSA

1.2.2 人工抗原鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定

用PBS溶液配制BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其與免疫抗原的濃度相一致。用紫外-可見分光光度計(jì)掃描，在波長(zhǎng)220～440 nm范圍內(nèi)可得最大吸收峰及特征值的掃描圖。

1.2.2.2 SDS-PAGE鑒定

參照文獻(xiàn)[14]的方法，配制電泳所需濃縮膠和分離膠。由于分離蛋白分子質(zhì)量相對(duì)較大，因此選擇濃縮膠（5%）、分離膠（10%），上樣量20 μL、濃縮膠電壓60 V，時(shí)間大約30 min。分離膠的電壓為100 V，直到完全結(jié)束為止?？捡R斯亮藍(lán)染色3～4 h后，置于脫色液中脫色，更換3～4 次脫色液。對(duì)SDS-PAGE膠進(jìn)行掃描照相，依據(jù)蛋白條帶位置差異來(lái)判斷偶聯(lián)效果。

1.2.3 免疫學(xué)方法制備兔多抗

將兩種免疫原溶解于無(wú)菌PBS溶液中，首次免疫使用弗式完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗式不完全佐劑，用乳化器對(duì)其進(jìn)行乳化，待溶液變成白色乳濁液后進(jìn)行免疫。選取潔凈3 月齡新西蘭大白兔3 只，分別編號(hào)1號(hào)為PMG-EDC-BSA，2號(hào)和3號(hào)為PMG-GA-BSA，在頸部的皮下4點(diǎn)進(jìn)行注射。免疫劑量為1 mL/只，蛋白含量為150 μg/只。每次免疫間隔時(shí)間為3 周，第3次免疫之后30 d，對(duì)大白兔進(jìn)行耳緣靜脈采血。取血10 μL溶于990 μL生理鹽水中，5 000 r/min離心5 min，取出上清液，4℃保存待用。

1.2.4 多抗效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法對(duì)多抗進(jìn)行效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。取PMG-OVA包被好的聚苯乙烯板。第1步，用雙蒸水鋪底50 μL/孔（第1行不加），在第1行內(nèi)加入兔血清100 μL/孔，從第1行內(nèi)取出50 μL/孔，加入第2行，依次向下倍比到最后一行。由于要保持實(shí)驗(yàn)中溶液體系一致，在倍比后的每孔中都加入50 μL雙蒸水。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)有空白對(duì)照組，室溫放置30 min，洗滌4 次；第2步，加入羊抗兔二抗，用PBST溶液1∶1 000倍稀釋，50 μL/孔，室溫放置30 min，洗滌4 次；第3步，加入TMB顯色液100 μL/孔，室溫反應(yīng)10 min；最后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)OD450nm。以待測(cè)孔OD450nm值不小于空白對(duì)照 OD450nm值的2.1 倍（P/N≥2.1），判定為陽(yáng)性孔。

1.2.5 多抗半數(shù)抑制濃度的測(cè)定

將效價(jià)測(cè)定步驟的第一步中，倍比后的50 μL雙蒸水，替換為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。其他的實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.4節(jié)。

1.2.6 多抗交叉反應(yīng)的測(cè)定

使用有機(jī)磷類農(nóng)藥亞胺硫磷、毒死蜱、馬拉硫磷、敵敵畏，對(duì)硫磷以及載體蛋白BSA和OVA作為競(jìng)爭(zhēng)物，利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定兔多抗對(duì)各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50。以兔多抗對(duì)PMG的IC50與各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50的百分比作為其交叉反應(yīng)率（cross-reactivity，CR）。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

2.1.1 紫外掃描鑒定結(jié)果

圖3 BSA、PMG、PMG-EDC-BSA、PMG-GA-BSA紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of BSA, PMG, PMG-EDC-BSA and PMG-GA-BSA

如圖3可以看出，BSA在280 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。PMG-BSA偶聯(lián)后的紫外吸收峰與BSA相比發(fā)生了一定的位移，兩種偶聯(lián)物在波長(zhǎng)310 nm和330 nm處均出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明偶聯(lián)成功。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

圖4 PMG-BSA的SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.4 Identifi cation of PMG-BSA by SDS-PAGE

SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖4所示，BSA和免疫原PMGBSA的分子質(zhì)量均在63～75 kD之間，但PMG-BSA的遷移距離小于未偶聯(lián)的BSA。經(jīng)過對(duì)比可知，PMGBSA的分子質(zhì)量較BSA有所增加，可初步說(shuō)明人工抗原偶聯(lián)成功。

2.2 多抗的鑒定結(jié)果

2.2.1 間接ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果

表1 間接ELISA測(cè)定多抗效價(jià)Table1 Titer of antisera detected by indirect ELISA

由表1可知，免疫3 只兔子效價(jià)均達(dá)到1∶1×104以上，其中1號(hào)兔子的血清效價(jià)最高，可達(dá)到1∶5.12×104，即證明免疫原注射得到了較好的免疫效果，同時(shí)ELISA結(jié)果也表明實(shí)驗(yàn)合成的包被原也具有良好的效果。

2.2.2 多抗的敏感性鑒定結(jié)果

表2 多抗敏感性的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定的OD450nm值Table2 Sensitivity of polyclonal antiserum detected by indirect competitive ELISA

圖5 多抗對(duì)PMG的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制曲線Fig.5 Inhibitory curve for pAb against PMG detected by indirect competitive ELISA

由表2可知，3 只大白兔的多抗均對(duì)PMG農(nóng)藥有抑制，抑制曲線如圖5所示，其中1號(hào)大白兔的IC50為43.4 μg/mL，2號(hào)大白兔的IC50為30.9 μg/mL，3號(hào)大白兔的IC50為41.1 μg/mL。表明2號(hào)兔子的多抗對(duì)PMG農(nóng)藥的敏感性較強(qiáng)。

2.2.3 多抗的特異性鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中用1號(hào)兔子的多抗與有機(jī)磷類農(nóng)藥進(jìn)行交叉反應(yīng)。由表3可知，多抗與有機(jī)磷類農(nóng)藥亞胺硫磷、毒死蜱、馬拉硫磷、敵敵畏，對(duì)硫磷以及載體蛋白BSA和OVA的CR低，具有很好的特異性。

表3 多抗與其他有機(jī)磷類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)Table3 Cross-reactivity of rabbit antiserum with other organophosphorus pesticides

3 討 論

3.1 抗原的設(shè)計(jì)合成

針對(duì)半抗原的設(shè)計(jì)、修飾、載體的選擇、半抗原與載體的偶聯(lián)、人工抗原的鑒定等方面進(jìn)行全面的設(shè)計(jì)與分析[15]，才能得到良好的人工抗原，以刺激動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)半抗原的特異性抗體。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)了兩種不同的方法進(jìn)行人工抗原的偶聯(lián)，針對(duì)不同的偶聯(lián)方法，要選擇合適的偶聯(lián)條件，還應(yīng)注意偶聯(lián)時(shí)的加入順序，避免蛋白發(fā)生自身偶聯(lián)。

3.2 人工抗原的鑒定

在合成人工抗原后，通常先進(jìn)行物理化學(xué)方法的初步鑒定，常用的小分子人工抗原鑒定方法有可見-紫外分光光度法[16-17]、SDS-PAGE電泳[18]、示蹤同位素法[19]、三硝基苯磺酸法[20]、電噴霧離子化質(zhì)譜法[21]、基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法[22]等。本實(shí)驗(yàn)利用了前兩種方法對(duì)偶聯(lián)效果進(jìn)行了鑒定，方法簡(jiǎn)單易操作、可行性高，且兩種方法的鑒定結(jié)果相吻合。

3.3 免疫劑量的選擇

根據(jù)以上免疫學(xué)特性鑒定結(jié)果可知，所合成的免疫原經(jīng)免疫大白兔之后，獲得了敏感性好，特異性強(qiáng)的多抗。免疫劑量對(duì)多抗的效價(jià)有很重要的作用，因此免疫的劑量選擇也是關(guān)鍵問題。根據(jù)前人對(duì)于免疫劑量的探索，本實(shí)驗(yàn)選擇的免疫劑量為1 mL/只，蛋白含量為150 μg/只。

3.4 合成方法對(duì)多抗的影響

免疫大白兔后得到的多抗，其效價(jià)有一定差異，分析其原因大致為兩種。其一，免疫前所設(shè)計(jì)免疫劑量相同，但免疫時(shí)由于人工注射，可能存在一定的誤差；其二，免疫動(dòng)物存在個(gè)體差異，導(dǎo)致抗體的效價(jià)差異。EDC法的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，所需要的條件穩(wěn)定，得到兔源多抗的效價(jià)較高。而GA法，需要避光反應(yīng)，且反應(yīng)所需藥品毒性較強(qiáng)，合成的人工抗原穩(wěn)定性較差。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過EDC法和GA法成功合成了PMG人工抗原，并免疫新西蘭大白兔得到了高效、敏感、特異的兔源多抗，對(duì)PMG的免疫學(xué)檢測(cè)體系進(jìn)行了初步的探索。通過對(duì)比表明，兩種偶聯(lián)方法都可行。本實(shí)驗(yàn)成功制備兔源多抗，為今后進(jìn)一步篩選鼠源的單抗提供參考依據(jù)。

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Preparation of Artif i cial Antigen and ELISA Identif i cation of Rabbit Polyclonal Antiserum for the Detection of Glyphosate

WANG Jing1,2, WANG Yao2,*, WANG Fangyu1,*, DENG Ruiguang1, HU Xiaofei1, YU Qiuying1, HAO Junfang1, XING Yunrui1,2, HOU Yuze2
(1. Henan Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agriculture Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2. Henan Engineering Laboratory of Livestock Disease Diagnosing and Food Safety Testing, College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

To obtain polyclonal antiserum with high sensibility and specificity, artificial antigens were synthesized by coupling glyphosate (PMG) with the carrier proteins bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) separately by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and glutaraldehyde (GA) methods in this study. As a result, the immune antigen PMG-BSA and detection antigen PMG-OVA were obtained and identif i ed by UV spectroscopy and SDS-PAGE. New Zealand white rabbits were immunized with PMG-EDC-BSA and PMG-GA-BSA, respectively to obtain polyclonal antisera. The titer of the antisera was determined by indirect ELISA and their sensibility and specif i city were determined by indirect competitive ELISA. The results showed that the titer of antiserum of all three immunized rabbits was higher than 1:104. The antiserum of rabbit 2 exhibited the highest sensibility with an IC50of 30.9 μg/mL and good specif i city. The successful synthesis of artif i cial antigens and the obtainment of PMG polyclonal antiserum with high sensibility and specif i city may lay the foundation for rapid immunological detection of PMG.

glyphosate; artif i cial antigen; polyclonal antiserum; ELISA

10.7506/spkx1002-6630-201704011

S482.4

A

1002-6630（2017）04-0065-05

王晶, 王耀, 王方雨, 等. 草甘膦人工抗原的制備及兔源多抗的ELISA鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 65-69.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704011. http://www.spkx.net.cn

WANG Jing, WANG Yao, WANG Fangyu, et al. Preparation of artificial antigen and ELISA identification of rabbit polyclonal antiserum for the detection of glyphosate[J]. Food Science, 2017, 38(4): 65-69. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704011. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD13B05）；河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（13480062）；河南省基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目（142300413222）

王晶（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：15038551637@163.com

*通信作者：王耀（1986—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：wangyao@haust.edu.cn

王方雨（1978—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：sprinkle.w@126.com