韋雪亮 黃 玲 岑人軍

(廣西大學(xué)體育學(xué)院體育訓(xùn)練系，廣西 桂林 530004)

運動性骨骼肌損傷致細(xì)胞凋亡的機制

韋雪亮 黃 玲1岑人軍

(廣西大學(xué)體育學(xué)院體育訓(xùn)練系，廣西 桂林 530004)

目的 探討運動性骨骼肌損傷引起細(xì)胞凋亡的機制。方法 選取健康8周齡雄性SD大鼠40只，隨機分為安靜對照組和力竭運動組，每組20只。采用一次力竭性跑臺運動。力竭運動后24 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC雙染法檢測細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸測定骨骼肌細(xì)胞凋亡率。應(yīng)用Western印跡技術(shù)測定骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達水平。結(jié)果 力竭運動后24 h，力竭運動組與安靜對照組比較，骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達水平降低(P<0.01)，Bax表達水平升高(P<0.01)。結(jié)論 力竭運動可以引起骨骼肌細(xì)胞損傷發(fā)生細(xì)胞凋亡，其機制可能為下調(diào)Bcl-2表達、上調(diào)Bax表達，促進細(xì)胞凋亡。

力竭運動；骨骼??；凋亡；Bcl-2；Bax

力竭運動可以導(dǎo)致骨骼肌的損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)這種損傷不僅表現(xiàn)為機體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強、氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡、影響骨骼肌正常功能，還可使骨骼肌細(xì)胞凋亡增加〔1〕。但關(guān)于運動性骨骼肌損傷后細(xì)胞凋亡機制的研究較少。基于此，本課題通過觀察一次力竭運動對大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2及Bax表達的影響，探討運動性骨骼肌損傷引起細(xì)胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取健康8周齡雄性SD大鼠40只，平均體重(200±20)g。給大鼠編號，按照數(shù)字表隨機分為安靜對照組和力竭運動組，每組20只。各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異，飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度20℃～25℃，濕度45%±5%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.2 方法 實驗前3 d對全部大鼠進行預(yù)適應(yīng)跑臺訓(xùn)練，參數(shù)：坡度0°，速度10 m/min，時間10 min。正式實驗采用一次力竭性跑臺運動，參數(shù)：坡度-16°，速度16 m/min，總運動時間200 min(中間5 min休息)。在運動初始，大鼠行為無異常，跑步速度均勻，步態(tài)穩(wěn)定；隨著時間推移開始出現(xiàn)不能持續(xù)運動，四肢沉重?zé)o力，漸漸不能支撐軀體，腹部接近跑臺。當(dāng)運動至200 min時，大鼠腹部皮毛濕潤，四足腫脹，呼吸不均，精神呆滯，反應(yīng)變慢，基本無逃避反應(yīng)。此時，根據(jù)大鼠力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠已經(jīng)力竭。

1.3 標(biāo)本的取材處理與觀察指標(biāo)

1.3.1 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染技術(shù)測定大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡率 力竭運動后24 h，選取相應(yīng)組別大鼠，腹腔麻醉，分離、切除肱三頭肌，小心修剪，剔除筋膜、血管、神經(jīng)、脂肪等組織，然后將骨骼肌剪碎，通過不銹鋼網(wǎng)(100目)進行加壓過濾，加入RPMI1640培養(yǎng)液，4℃靜置5 min，收集上清液，4℃、3 500 r/min、10 min 離心，棄上清，加入細(xì)胞裂解液3 ml，吹打混勻，再次4℃、3 500 r/min、10 min 離心，再次用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，然后用全自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，最終制成的骨骼肌單細(xì)胞混懸液濃度為5×105/ml。然后應(yīng)用碧云天AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸測定骨骼肌細(xì)胞凋亡率。具體操作步驟按照試劑說明書進行。結(jié)果判斷：正常細(xì)胞Annexin V及PI均低染(Annexin V-，PI-)，分布在左下區(qū)；早期細(xì)胞凋亡Annexin V高染，PI低染(Annexin V+，PI-)，分布在右下區(qū)；晚期凋亡及壞死細(xì)胞Annexin V及PI均高染(Annexin V+，P+)，分布在右上區(qū)。

1.3.2 Western印跡技術(shù)測定骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達 同樣方法取大鼠肱三頭肌標(biāo)本100 mg，在勻漿器中勻漿，加細(xì)胞裂解液后冰上裂解30 min，然后離心4℃、12 000 r/min、15 min，最后提取蛋白上清液，并進行濃度測定。測定結(jié)束后，加上樣緩沖液，然后混勻，100℃沸水中變性3 min，最后在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。Western印跡檢測依照配制分離膠和基層膠，制膠板；加樣；電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉，一抗過夜孵育，二抗孵育，曝光順序進行。提取、變性、測定蛋白濃度按照碧云天Western及IP細(xì)胞裂解液說明書進行。配置分離膠的濃度為10%。加樣蛋白總量30 μg。電泳前半小時電壓為110 V，后1 h為75 V。轉(zhuǎn)膜時間為2 h。一抗Bcl-2、Bax選擇CST公司。二抗選擇北京中杉金橋公司。曝光選擇康為高靈敏度發(fā)光劑，具體操作按照試劑說明書進行。結(jié)果采用gel-pro圖像分析軟件進行分析，計算灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

力竭運動后24 h，力竭運動組與安靜對照組比較骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達水平降低(P<0.01)，Bax表達水平升高(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 力竭運動對大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、 Bax表達的影響(n=20)

與安靜對照組比較：1)P<0.01

圖1 力竭運動對大鼠骨骼肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達的影響

3 討 論

運動性骨骼肌損傷的概念是指在訓(xùn)練或者運動的過程中，因局部骨骼肌過于用力或者負(fù)荷較大，超出了機體正常所能承受的范圍，同時運動后的肌肉未得到有效休息及恢復(fù)，從而導(dǎo)致骨骼肌組織發(fā)生損傷。運動性骨骼肌損傷不但包括骨骼肌解剖組織超微結(jié)構(gòu)的異常，而且還可伴有分子、基因、蛋白水平的異常。雖然運動引起骨骼肌損傷的機制目前尚不完全清楚，但可能機制包括：①機械損傷假說；②自由基損傷學(xué)說；③鈣離子超載學(xué)說；④急性炎癥反應(yīng)學(xué)說等。過去一段時間研究也大多集中在上述學(xué)說〔2～6〕。但近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷還與骨骼肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。宋衛(wèi)紅等〔7〕對大鼠進行重復(fù)3 d 的力竭離心運動,然后采用TUNNEL法檢測大鼠肱三頭肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)運動組凋亡指數(shù)明顯高于對照組,運動即刻凋亡指數(shù)開始升高,24 h 達到峰值，48 h 凋亡指數(shù)有所下降。趙曉琴〔8〕實驗研究亦發(fā)現(xiàn)離心運動可以引起骨骼肌細(xì)胞凋亡。任文寧〔9〕實驗研究發(fā)現(xiàn)大強度有氧運動可以促進大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡，并且對比目魚肌細(xì)胞凋亡的促進程度大于腓腸肌細(xì)胞凋亡。本研究表明一次力竭運動可以引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡，是機體不可或缺的生命過程，是機體進行正常新陳代謝的前提條件。機體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑除了最常見的線粒體途徑外，還包括死亡受體途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。研究最多的線粒體途徑是指當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號刺激后，使Bax亞族蛋白寡聚化進入線粒體，線粒體釋放相應(yīng)化學(xué)物質(zhì)形成凋亡體，從而引起細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡途徑的實現(xiàn)受多種基因調(diào)控，其中最重要的是Bcl-2家族。而Bcl-2家族最常見基因包括〔10〕：①抗細(xì)胞凋亡基因，以Bcl-2為代表，其又被稱為原癌基因。②促進細(xì)胞凋亡基因，以Bax為代表，又被稱為抑癌基因。③Bcl-2同源基因，以Bik、Blk、Bad和Bid等為代表，具有促進細(xì)胞凋亡作用。Bax促進細(xì)胞凋亡的機制除了與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，進而失去抑制細(xì)胞凋亡活性，還可單獨形成同源二聚體達到促進細(xì)胞凋亡作用〔11〕。Bcl-2/Bax異源二聚體在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，兩者比值決定了細(xì)胞凋亡與否：通常來說比值升高可抑制細(xì)胞凋亡，而比值下降則促進細(xì)胞凋亡。鑒于此，本研究應(yīng)用Western印跡法測定力竭運動后24 h肱三頭肌組織中Bcl-2及Bax表達情況，表明一次力竭運動引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機制可能為下調(diào)Bcl-2表達、上調(diào)Bax表達。李惠翔等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)力竭訓(xùn)練大鼠骨骼肌細(xì)胞中Bcl-2表達水平顯著下降，而Fas 蛋白表達水平增加，引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成骨骼肌損傷。王冬梅等〔13〕研究運動對大鼠骨骼肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及相關(guān)凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax表達水平的影響，一次游泳力竭組大鼠骨骼肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度明顯增加(P<0.01)，Bcl-2基因表達顯著減少，Bax 基因表達顯著增加，Bcl-2/Bax 比值顯著減小(P<0.01)。說明運動訓(xùn)練可通過改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達，調(diào)控骨骼肌細(xì)胞凋亡。劉寧寧等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)有氧運動能優(yōu)化Bcl-2/Bax的比值，降低骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，有效減少衰老導(dǎo)致的骨骼肌過度凋亡。因此，通過本次實驗研究結(jié)果可得出力竭運動可以引起骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機制可能為下調(diào)Bcl-2表達、上調(diào)Bax表達。本實驗可為制定適當(dāng)合理強度運動方案提供科學(xué)依據(jù)，但本研究只是從線粒體途徑研究誘導(dǎo)凋亡機制，下一步將從其他凋亡途徑進一步探討力竭運動誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡的機制。

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5 劉 翔,熊正英.茜草提取物對大強度耐力訓(xùn)練大鼠股四頭肌ATP酶活性及運動能力影響的實驗研究〔J〕.天津體育學(xué)院學(xué)報,2006;21(6):514-7.

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12 李惠翔,趙紅軍,李曉莉.不同運動強度訓(xùn)練對大鼠骨骼肌細(xì)胞Bcl-2、FAS表達的影響〔J〕.中外醫(yī)療,2008;27(33):12-3.

13 王冬梅,漆正堂,丁樹哲.骨骼肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及bcl-2和bax mRNA表達與運動〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011;15(33):6182-6.

14 劉寧寧,李明學(xué),金 雯.有氧運動對衰老大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響〔J〕.江蘇大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013;23(3):229-32,237.

〔2016-08-31修回〕

(編輯 袁左鳴)

韋雪亮(1978-)，男，講師，碩士，主要從事體育教學(xué)訓(xùn)練研究。

R685.4

A

1005-9202(2017)04-0829-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.019

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科