王宏艷 關(guān)淑芬 趙旭偉 史洪強(qiáng)

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

不同劑量低分子姬松茸多糖聯(lián)合OVA誘導(dǎo)ICR小鼠Th1/Th2免疫反應(yīng)的機(jī)制

王宏艷 關(guān)淑芬 趙旭偉 史洪強(qiáng)1

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的 探討不同劑量低分子姬松茸多糖(LMPAB)聯(lián)合OVA誘導(dǎo)ICR小鼠Th1/Th2免疫反應(yīng)的機(jī)制。方法 將84只6～8周齡體質(zhì)量(18±2)g SPF級(jí)雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組(n=12)，即OVA組(OVA 100 μg/只)、Alum組(OVA 100 μg/只+Alum 200 μg/只)、LMPAB-1組(LMPAB 25 μg/只+OVA 100 μg/只)、LMPAB-2組(LMPAB 50 μg/只+OVA 100 μg/只)、LMPAB-3組(LMPAB 100 μg/只+OVA 100 μg/只)、LMPAB-4組(LMPAB 200 μg/只+OVA 100 μg/只)及LMPAB-5組(LMPAB 400 μg/只+OVA 100 μg/只)，分別于1 d和15 d背部皮下兩點(diǎn)注射免疫，28 d后分別取抗凝血及脾并分別分離血清及脾淋巴細(xì)胞，采用CCK-8法及ELISA 法觀察不同劑量LMPAB聯(lián)合OVA分別誘導(dǎo)ICR小鼠對(duì)其脾淋巴細(xì)胞增殖及特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG表達(dá)的影響。結(jié)果 與OVA組相比，LMPAB-1、2、3、4組對(duì)OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞有一定促進(jìn)增殖作用(P<0.05)，且LMPAB-2、3、4、5組IgG1、IgG2b、IgG表達(dá)均較明顯(P<0.05)；與Alum組比較，不同劑量LMPAB組IgG1表達(dá)均相對(duì)較弱(P<0.05)，LMPAB-2、3、4組IgG2b表達(dá)明顯(P<0.05)，而LMPAB-1、2、5組IgG表達(dá)較弱(P<0.05)。結(jié)論 LMPAB能夠輔助OVA促進(jìn)受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)激活并改善Th1/Th2免疫功能。

低分子量姬松茸多糖；OVA

目前，新型免疫佐劑在疫苗領(lǐng)域的研究和發(fā)展已受到眾學(xué)者的廣泛關(guān)注與高度重視。免疫佐劑疫苗不僅可優(yōu)化、增強(qiáng)疫苗本身的免疫原性，還可促進(jìn)激活宿主對(duì)抗原的保護(hù)性應(yīng)答〔1〕，但目前通過FDA批準(zhǔn)可用于人的佐劑僅有鋁膠佐劑，其制備、保存等技術(shù)尚未成熟且免疫佐劑效果差〔2〕。因此，尋找安全、高效的佐劑對(duì)人工免疫方向的研究尤為重要。低分子姬松茸多糖(LMPAB)為姬松茸子實(shí)體中提取的低分子量(50 kD)多糖，具有較強(qiáng)免疫刺激活性并可提高細(xì)胞免疫和體液免疫〔3〕。故本課題組將LMPAB作為佐劑，通過不同劑量LMPAB聯(lián)合OVA誘導(dǎo)ICR小鼠，觀察其對(duì)免疫小鼠Th1/Th2免疫反應(yīng)的影響，為新型佐劑的研發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購于白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)雄性 ICR小鼠，體重(18±2)g，6～8周齡，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2007-0003，室溫飼養(yǎng)，正常飲食水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 LMPAB是由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)提取、分離、高效液相排阻色譜技術(shù)等從姬松茸子實(shí)體中提取的低分子(50 kD)多糖；RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清(Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(Biosharp公司)；ConA(Type IV)、OVA(Grade V)(Sigma公司)；IgG2b、IgG1 ELISA定量試劑盒(SBA公司)；IgG ELISA定量試劑盒(中杉金橋公司)等。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，MCO-18AIC)；酶聯(lián)免疫儀(美國BIO-RAD公司，iMark 1509)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMOUS，IX81)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 將84只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組(n=12)，OVA組：每只注射100 μg OVA；Alum組：每只注射OVA 100 μg、Alum 200 μg；LMPAB-1組：每只注射LMPAB 25 μg、OVA 100 μg；LMPAB-2組：每只注射LMPAB 50 μg、OVA 100 μg；LMPAB-3組：每只注射LMPAB 100 μg、OVA 100 μg；LMPAB-4組：每只注射LMPAB 200 μg、OVA 100 μg；LMPAB-5組：每只注射LMPAB 400 μg、OVA 100 μg。分別于實(shí)驗(yàn)開始的1 d和15 d采用背部皮下兩點(diǎn)注射的方式對(duì)各組小鼠進(jìn)行免疫處理。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 脾淋巴細(xì)胞的制備〔4〕28 d后予以脫頸處死，無菌環(huán)境下取脾，研磨器研磨脾臟，使其單個(gè)細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)進(jìn)入裝有淋巴細(xì)胞分離液的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移含有脾臟細(xì)胞的分離液至15 ml離心管內(nèi)，加入0.5～1 ml RPMI1640培養(yǎng)基，室溫下1 000 r/min離心20 min，收集淋巴細(xì)胞層至另一支15 ml離心管中并加入10 ml RPMI1640培養(yǎng)基，800 r/min離心2次，10 min/次，重新加入RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

1.5.2 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測〔5〕于96孔培養(yǎng)板中每孔加100 μl脾淋巴細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，各孔加等體積的ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞刺激組溶液(終濃度為5 μg/ml)，重復(fù)4孔，用RPMI1640(100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素雙抗，10%小牛血清)補(bǔ)到200 μl/孔，另設(shè)空白對(duì)照組(只用 RPMI1640補(bǔ)至200 μl/孔)，依據(jù)CCK-8試劑盒說明書對(duì)各組脾淋巴細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測。

1.5.3 特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG檢測〔6〕28 d后眼部取血，分離并收集各組血清，依據(jù)IgG1、IgG2b、IgG ELISA定量試劑盒說明書分別對(duì)IgG1、IgG2b、IgG的含量進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量LMPAB對(duì)OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 與OVA組(0.251±0.037)相比，LMPAB-1、2、3、4組(分別為0.284±0.011，0.318±0.014，0.336±0.023，0.307±0.033)存在明顯差異(P<0.05)，表明一定劑量LMPAB對(duì)OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞有一定的增殖促進(jìn)作用。Alum組為0.327±0.026，LMPAB-5組為0.254±0.041。

2.2 不同劑量LMPAB對(duì)OVA受免小鼠特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG表達(dá)的影響 與OVA組相比，LMPAB-2、3、4、5組特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG的表達(dá)存在明顯差異(P<0.05)；與Alum組比較，不同劑量LMPAB各組特異性抗體IgG1表達(dá)均相對(duì)較弱(P<0.05)，LMPAB-2組、LMPAB-3組、LMPAB-4組IgG2b表達(dá)明顯(P<0.05)，而LMPAB-1組、LMPAB-2組及LMPAB-5組IgG表達(dá)較弱(P<0.05)。見圖1。

與OVA組比較：1)P<0.05；與Alum組比較：2)P<0.05圖1 不同劑量LMPAB對(duì)OVA受免小鼠特異性抗體IgG1、 IgG2b、IgG表達(dá)的影響

3 討 論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LMPAB毒副作用小，并具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等作用〔3，7，8〕。因此，LMPAB有望成為一種安全、高效的免疫佐劑。然而，LMPAB增強(qiáng)免疫的機(jī)制尚未明確。

IgG為血清主要的抗體成分〔9〕，主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用，IgG的種類和數(shù)量通常可決定Th細(xì)胞活化的分化方向并最終影響免疫應(yīng)答類型。IgG1 和 IgG2b 為IgG抗體亞類，IgG1 和 IgG2b可分別用于評(píng)價(jià) Th1 和 Th2 免疫反應(yīng)的類型。

本文結(jié)果說明LMPAB可激活受免小鼠的免疫功能；不同劑量LMPAB可明顯促進(jìn)免疫小鼠IgG1、IgG2b、IgG表達(dá)，此結(jié)果與崔立然等〔10〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明LMPAB不僅具有激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答的能力，而且還可以增強(qiáng)Th1型抗體亞類的特性，這與Alum組僅可以激活Th2型免疫應(yīng)答、而無法作用于Th1免疫應(yīng)答形成鮮明對(duì)比。

綜上所述，LMPAB能夠促進(jìn)受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，可激活并改善Th1/Th2免疫功能，本次實(shí)驗(yàn)為LMPAB成為安全、高效的新型免疫佐劑提供了一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但由于Th1/Th2細(xì)胞平衡涉及因子頗多且其免疫機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，LMPAB改善機(jī)體免疫功能的機(jī)制仍需深入研究。

1 崔倩倩，周志勇，劉超奇，等.植物多糖作為免疫佐劑的研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015；26(4)：970-2.

2 Marrack P，McKee AS，Munks MW.Towards an understanding of the adjuvant action of aluminium〔J〕.Nat Rev Immunol，2009；9(2)：287-93.

3 崔立然，王桂梅，孫立冬，等.低分子量姬松茸多糖的免疫活性研究〔J〕.中醫(yī)藥信息，2013；30(2)：10-3.

4 王 彥，王長征.MTT法檢測卵蛋白刺激哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖最佳實(shí)驗(yàn)條件的研究〔J〕.毒理學(xué)雜志，2014；28(3)：170-3.

5 徐 月，葛會(huì)奇，高 慧，等.五味子不用炮制品對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015；21(14)：116-9.

6 張偉偉，朱繼峰，王 任，等.白藜蘆醇調(diào)控TH1和TH2應(yīng)答抑制小鼠日本血吸蟲病肝臟纖維化的研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2016；32(8)：1091-7.

7 牛英才，趙學(xué)梅，張 春，等.低分子量姬松茸多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織CD44 mRNA表達(dá)的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2008；35(10)：1482-4.

8 張 春，趙學(xué)梅，周 麗，等.MTT法測定低分子量姬松茸多糖體外抗腫瘤活性〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009；30(1)：1-2.

9 彭小彬，邱小慧，余傳林，等.茯苓多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠體液免疫功能〔J〕.中藥藥理與臨床，2013；29(5)：69-72.

10 崔立然，李洪軍，王紅艷，等.姬松茸多糖促進(jìn)OVA抗原免疫反應(yīng)的研究〔J〕.基礎(chǔ)研究，2014；38(11)：18-20.

〔2016-09-17修回〕

(編輯 郭 菁)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(12531800)

王宏艷(1973-)，女，副主任中藥師，主要從事中藥藥劑及中藥藥理研究。

R979.5

A

1005-9202(2017)04-0827-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.018

1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院