袁 博 王金海 方曉麗 張星華 田 亮 張婷卓 李興蘭 杜小正 曾華宗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)寒證類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型家兔滑膜組織代謝物譜的影響

袁 博 王金海1方曉麗 張星華 田 亮 張婷卓 李興蘭 杜小正 曾華宗2

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討比較不同針?lè)▽?duì)寒證類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型家兔滑膜組織代謝物譜的影響及熱補(bǔ)針?lè)ㄖ委烺A的特異性機(jī)制。方法 40只清潔級(jí)青紫藍(lán)家兔隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針?lè)ńM，每組8只。以卵蛋白誘導(dǎo)聯(lián)合低溫冷凍法建立寒證RA模型。除正常組、模型組外，其余各組分別于足三里穴施以平補(bǔ)平瀉、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法、熱補(bǔ)針?lè)ㄡ槾蹋?次/d，留針30 min，共7次。治療結(jié)束后分離家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，采用液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q/TOF-MS)檢測(cè)滑膜組織代謝物，利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 與正常組比較，模型組滑膜組織代謝物變化主要體現(xiàn)于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、異亮氨酸/亮氨酸、纈氨酸含量降低(P<0.05)；與模型組比較，各針刺組上述代謝物含量增高(P<0.05)，且熱補(bǔ)針?lè)ńM肌酸、異亮氨酸/亮氨酸、纈氨酸含量明顯高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組。結(jié)論 熱補(bǔ)針?lè)ㄍㄟ^(guò)調(diào)節(jié)與RA能量代謝相關(guān)的氨基酸代謝，在改善RA機(jī)體氨基酸的供給及減緩負(fù)氮平衡方面有一定的特異性作用。

熱補(bǔ)針?lè)ǎ活?lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜組織；代謝組學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病。針灸療法對(duì)RA具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)作用〔1〕?！盁嵫a(bǔ)針?lè)ā笔青嵖浇淌谠趥鹘y(tǒng)針刺手法的基礎(chǔ)上，把握“燒山火”之精髓，去繁就簡(jiǎn)而創(chuàng)立的特色手法，是臨床治療RA的結(jié)晶。課題組前期的研究表明，熱補(bǔ)針?lè)▽?duì)RA在抗炎鎮(zhèn)痛層面具有相對(duì)的特異性〔2〕，但前期這些研究尚不能體現(xiàn)針灸多靶點(diǎn)、多層次、多途徑以及類(lèi)似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用特點(diǎn)，缺乏對(duì)針刺后機(jī)體產(chǎn)生的全部生物信息的綜合分析。代謝組學(xué)是通過(guò)對(duì)某一生物、細(xì)胞或組織相對(duì)分子質(zhì)量較低(相對(duì)分子質(zhì)量<1 000)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析檢測(cè)，從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究機(jī)體發(fā)病以及治療機(jī)制的新技術(shù)〔3〕。因此，該研究手段的優(yōu)勢(shì)與針灸治療作用特點(diǎn)甚相吻合。本研究以寒證RA模型家兔為載體，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討熱補(bǔ)針?lè)ㄖ委烺A的特異性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康2～3月齡清潔級(jí)青紫藍(lán)家兔40只，雌雄各半，體重(2.5±0.5)kg(購(gòu)自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所，許可證號(hào)：SCXK(甘)2012-0001)。購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后隨機(jī)分為正常組、模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組、熱補(bǔ)針?lè)ńM，每組8只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)所有動(dòng)物的處理方法均符合2006年國(guó)家科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》的規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 卵蛋白干粉(sigma 公司，批號(hào)：A5253-250G)；弗氏完全佐劑(CFA，sigma 公司，批號(hào)：F5881)；LC/MS級(jí)乙腈(Merck公司)；高效液相色譜檢測(cè)(HPLC)級(jí)甲醇(Merck公司)；甲酸(CNW公司)；針灸針(華成牌，蘇州)；LC-Q/TOF-MS儀器分析平臺(tái)(Agilent)；C18色譜柱(Agilent公司)。

1.3 造模方法 除正常組外，其余各組分別采用卵蛋白誘導(dǎo)聯(lián)合低溫冷凍法建立RA寒證模型〔4〕：實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前3 d，用電推剃去家兔背部肩胛骨間及雙后腿膝關(guān)節(jié)周?chē)拿?；? mg/ml的卵蛋白溶液與等量CFA充分混勻，震蕩成乳化劑，以2%碘酒、75%酒精消毒肩背部均勻選定的6個(gè)點(diǎn)，用注射器每點(diǎn)皮下注射該乳化劑0.2 ml；14 d后以相同方式、相同劑量重復(fù)皮下注射1次；第二次免疫后6 d，消毒家兔后腿雙膝關(guān)節(jié)，向關(guān)節(jié)內(nèi)分別注入20 mg/ml卵蛋白生理鹽水溶液0.4 ml。在24 h之內(nèi)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫觸痛，表明模型復(fù)制成功。在模型復(fù)制成功后第2天，用70%酒精消毒兩后腿，上、下、左、右圍置冰袋(3份冰+1份結(jié)晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20℃～-25℃)冷凍1.5 h，在45℃溫水中復(fù)溫5 min(室溫12℃)，共冷凍1次。冷凍后14 d，家兔表現(xiàn)為精神萎靡不振，兩后肢匍伏，膝關(guān)節(jié)腫脹、周徑明顯大于正常組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立寒證RA模型。

1.4 針刺方法 寒證RA模型建立成功后第7天，將家兔用改良后兔臺(tái)固定，選取“足三里”穴〔5〕。熱補(bǔ)針?lè)ú僮鲄⒄铡多嵤厢樉娜贰?〕：操作者左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內(nèi)8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續(xù)捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應(yīng)的部位，連續(xù)重插輕提5次；拇指再向前連續(xù)捻按5次，反復(fù)操作1 min，最后使針下沉緊，留針30 min。平補(bǔ)平瀉法、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法操作均參照《刺法灸法學(xué)》〔7〕：平補(bǔ)平瀉法：針刺得氣后，施以前后均勻捻轉(zhuǎn)，不單向捻轉(zhuǎn)，指力均勻，角度180°～360°，頻率60～90轉(zhuǎn)/min，反復(fù)操作1 min。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法：針刺得氣后，在針下得氣處小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體(角度180°～360°，頻率60～90轉(zhuǎn)/min)，拇指向前左轉(zhuǎn)時(shí)用力重，指力沉重向下；拇指向后右轉(zhuǎn)還原時(shí)用力輕，反復(fù)操作1 min。以上各操作每天1次，每次留針30 min，共針刺7 d。

1.5 滑膜樣本的采集 針刺治療結(jié)束后，采用空氣栓塞法處死各組家兔，分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，于凍存管內(nèi)置于-80℃冰箱保存，備測(cè)。

1.6 樣本處理 ①樣本前處理：室溫解凍后，吸取100 μl樣本于1.5 ml EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品∶甲醇=1∶4，渦旋30 s，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μl上清，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待檢測(cè)。②色譜條件：分離色譜柱為C18色譜柱。色譜分離條件：柱溫40℃；流速0.35 ml/min；流動(dòng)相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。進(jìn)樣量為4 μl，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。③質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子模式不同條件進(jìn)行檢測(cè)，為確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質(zhì)量，正離子模式下產(chǎn)生〔M+H〕+離子556.277 1 D，負(fù)離子模式下產(chǎn)生〔M-H〕-離子554.261 5 D。

表1 梯度洗脫程序

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Mass Profiler軟件對(duì)LC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，在Excel2007中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，然后將所有數(shù)據(jù)歸一化到總信號(hào)積分。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

2 結(jié) 果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查 對(duì)所有樣本的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行重疊。初步觀察發(fā)現(xiàn)儀器的保留時(shí)間重現(xiàn)性非常好，儀器穩(wěn)定，因而提高了儀器分析和數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。見(jiàn)圖1。

圖1 所有樣本正、負(fù)模式下TIC

2.2 PCA 采用PCA觀察樣本整體分布趨勢(shì)，各組樣本能夠較好的分離，各針刺組均向正常組回歸，且熱補(bǔ)針?lè)ńM較其他組尤為明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定 見(jiàn)圖3，圖4，表2，表3。為了更好地獲得導(dǎo)致這種差異的代謝物信息，采用OPLS-DA，根據(jù)化合物的精確分子量搜索在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metlin.scripps.edu/)，解析化合物的質(zhì)譜，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。選擇投影變量重要性(VIP)值(閾值>1)并結(jié)合t檢驗(yàn)中的P值(閾值<0.05)，篩選出差異物質(zhì)進(jìn)行鑒定，并計(jì)算差異物質(zhì)在每?jī)山M間變化倍數(shù)。具體變化倍數(shù)的計(jì)算方法：每組樣本有8例生物學(xué)重復(fù)，檢測(cè)出的每個(gè)樣本中的每種物質(zhì)的含量利用峰面積歸一化后求得每個(gè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰面積值，每組重復(fù)中取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并取以2為底的函數(shù)，即為表格中的Fold change值。模型組滑膜組織代謝物變化較正常組主要體現(xiàn)于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量降低(P<0.05)；各針刺組較模型組上述代謝物增高(P<0.05)，但各針刺組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而熱補(bǔ)針?lè)ńM肌酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量明顯高于平補(bǔ)平瀉組和捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組(P<0.05)。

A.正常組；B.熱補(bǔ)針?lè)ńM；C.捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組；D.平補(bǔ)平瀉組；E.模型組；下圖同圖2 各組家兔滑膜組織正、負(fù)模式下PCA得分圖

圖4 各組家兔滑膜組織負(fù)模式下OPLS-DA得分圖

ViPMasst檢驗(yàn)名稱(chēng)FoldchangeViPMasst檢驗(yàn)名稱(chēng)Foldchange2.04489.08730.048丙氨酸1.3041)1.513146.14810.014谷氨酰胺3.0993)2.227175.19310.040瓜氨酸23.3591)1.36775.07160.023甘氨酸2.2673)1.522115.13260.008脯氨酸0.7991)1.891147.130760.004谷氨酸5.3053)1.839146.14810.039谷氨酰胺1.0681)1.157379.24190.022鞘氨醇1-磷酸0.9673)1.53075.07160.017甘氨酸2.4091)3.04489.08730.008丙氨酸4.5494)1.711147.130760.044谷氨酸2.8221)1.675175.19310.006瓜氨酸2.2764)1.03989.08730.033丙氨酸2.8492)1.324115.13260.043脯氨酸1.2404)2.042175.19310.045瓜氨酸0.3332)1.345146.14810.009谷氨酰胺0.9474)1.019115.13260.041脯氨酸0.4132)

1)表示正常組與模型組比較，2)表示平補(bǔ)平瀉組與模型組比較，3)表示捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組與模型組比較，4)表示熱補(bǔ)針?lè)ńM與模型組比較，5)表示平補(bǔ)平瀉組與熱補(bǔ)針?lè)ńM比較，6)表示捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組與熱補(bǔ)針?lè)ńM比較；下表同

表3 負(fù)模式下各組潛在生物標(biāo)志物

-表示下降

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA是以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理改變的自身免疫系統(tǒng)疾病，雖然其具體發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但隨著系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)在RA機(jī)體內(nèi)氨基酸、脂質(zhì)以及葡萄糖代謝等發(fā)生了變化〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA機(jī)體內(nèi)氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，與上述研究相符，說(shuō)明RA的發(fā)病機(jī)制涉及途徑廣、層次多等復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度考慮，其發(fā)病機(jī)制與針灸的多靶點(diǎn)、多途徑、多層次以及類(lèi)似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的整體作用特點(diǎn)甚相合拍。

實(shí)驗(yàn)研究顯示丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺不僅對(duì)維持免疫功能起到重要的作用，它們還可作為氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抑制劑〔9〕；甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺三者作為谷胱甘肽(GSH)的重要組成成分，能夠保護(hù)生物膜免受自由基的損傷；本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M中上述代謝物含量均降低，可能使RA機(jī)體抗氧化能力下降而導(dǎo)致過(guò)氧化損傷加重、免疫功能低下、自由基傷害加深。磷脂在磷脂酶的作用下水解為溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，而溶血磷脂可以加重細(xì)胞膜的損傷〔10〕。FFA在酰基輔酶A合成酶(CoAS)作用下與溶血磷脂又合成磷脂〔11〕。因此磷脂代謝異常亦可造成細(xì)胞膜受損，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M中鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂含量均降低，造成細(xì)胞膜的損傷。肌酸常作為保護(hù)細(xì)胞膜的代謝物之一，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能〔12〕，模型組中的肌酸水平明顯降低，提示機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜的完整性降低、過(guò)氧化損傷加重。因此認(rèn)為，模型組中與細(xì)胞膜保護(hù)以及免疫功能有關(guān)的代謝物含量均降低，導(dǎo)致模型家兔的代謝紊亂，出現(xiàn)細(xì)胞膜和自由基的損傷、免疫力下降。針刺治療后，上述代謝物的含量均升高，提示針刺可減慢細(xì)胞膜破壞、過(guò)氧化損傷，改善機(jī)體的免疫功能。

目前眾多研究學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)是RA發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，RA滑液中存在著異常的T、B淋巴細(xì)胞和顯著升高的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素-1、-6、-17以及γ干擾素等促炎細(xì)胞因子〔13，14〕，這些因子不僅直接造成RA關(guān)節(jié)滑膜和組織的破壞，還可通過(guò)協(xié)同作用使機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、促神經(jīng)素釋放增多以及補(bǔ)體基因表達(dá)上調(diào)等反應(yīng)，從而影響RA機(jī)體的能量代謝水平，導(dǎo)致能量代謝不足的表現(xiàn)。體內(nèi)的異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸作為支鏈氨基酸，均參與機(jī)體蛋白質(zhì)的合成以及分解過(guò)程，具有提供能量底物調(diào)節(jié)的作用，可維持機(jī)體氮的平衡；谷氨酰胺作為機(jī)體儲(chǔ)藏量最多的必需氨基酸，是各組織供給能量的重要氮源以及能量來(lái)源〔15〕。模型組中上述代謝物的含量均降低，提示與能量代謝有關(guān)的必需氨基酸代謝發(fā)生了紊亂。而在針刺干預(yù)后各代謝物含量均升高，尤以熱補(bǔ)針?lè)ńM中各代謝物上升明顯，說(shuō)明熱補(bǔ)針?lè)軌蛘{(diào)節(jié)與RA能量代謝相關(guān)的氨基酸代謝，在改善機(jī)體氨基酸的供給和減緩負(fù)氮平衡方面具有一定的特異性作用。

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〔2016-04-13修回〕

(編輯 袁左鳴)

Metabonomics study on synovial tissues of rheumatoid arthritis cold syndrome rabbit treated with heat-reinforcing needling

YUAN Bo,WANG Jin-Hai,FANG Xiao-Li,etal.

Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Objective To compare the influence of metabolites in synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA) cold syndrome rabbits treated with different needling and investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control (NC),model control(MC),reinforcing-reducing needling group (RRN),twirling-reinforcing needling group (TRN) and heat-reinforcing needling group (HRN) (n=8). RA cold syndrome rabbit model was made with ovalbumin and freezing. Except NC and MC,RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli (ST36),TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli (ST36),and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli (ST36),once a day and retaining 30 min,for 7 times. Fresh synovial tissues of rabbit knee joints were extracted after the intervention,then liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-Q/TOF-MS) technology was used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) by using the SIMCA-P(13.0) software for windows. The results were compared. Results The synovial tissues metabolites concerning alanine,citrulline,proline,glutamine,glycine,glutamic acid,sphingolin1-phosphoric acid,lysoph-osphatidylcholine,creatine,isoleucine,leucine,and valine in MC mainly were decreased compared with NC(P<0.05). The above-mentioned metabolites were increased compared with MC and all acupuncture groups (P<0.05),but the metabolites concerning creatine,isoleucine,leucine,valine in HRN were obviously increased than those of RRN and TRN (P<0.05). Conclusions By adjusting the amino acids metabolism which is associated with RA energy metabolism,heat-reinforcing needling has specific effect on RA by improving supply of amino acids and relieving negative nitrogen balance.

Heat-reinforcing needling;Rheumatoid arthritis;Synovial tissue;Metabonomics;Liquid chromatography-mass spectrometry

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260558)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局甘肅鄭氏針?lè)▽W(xué)術(shù)流派傳承工作室項(xiàng)目(2305135901)；甘肅省自然科學(xué)基金(1208RJZA185)；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-1-247)

杜小正(1973-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事傳統(tǒng)針刺手法對(duì)免疫性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

袁 博(1990-)，男，碩士，主要從事傳統(tǒng)針刺手法對(duì)免疫性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)04-0800-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.008

1 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 2 上海聚類(lèi)生物科技有限公司