牟漢川 楊志寬 暴亞鋒 王玉玲 劉 靜 張繼虹

(昆明理工大學醫(yī)學院衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室，云南 昆明 650500)

他汀藥物對p53突變腫瘤細胞的作用及機制

牟漢川 楊志寬 暴亞鋒 王玉玲 劉 靜 張繼虹

(昆明理工大學醫(yī)學院衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室，云南 昆明 650500)

目的 研究他汀藥物對p53突變的腫瘤細胞的作用及分子機制。方法 采用具有突變p53背景的人結腸癌HT29細胞，通過MTT實驗檢測他汀藥物對細胞增殖的影響，用Western印跡檢測他汀藥物濃度梯度和時間梯度處理后細胞內突變p53，分子伴侶熱休克蛋白(HSP)90、p53信號通路下游靶蛋白PUMA、p21、凋亡相關蛋白PARP的表達情況。結果 MTT實驗結果顯示，他汀藥物會顯著抑制HT29細胞的增殖，美伐他汀IC50為(39.95±3.81)μmol/L，辛伐他汀IC50為(24.99±0.70)μmol/L。Western印跡結果顯示，隨著濃度和時間梯度增加，突變p53和HSP90表達水平沒有改變，但是，p53下游靶蛋白PUMA、p21的表達水平升高，PARP蛋白切割增強。結論 他汀藥物能夠抑制p53突變的腫瘤細胞的增殖，其機制可能是將突變型p53恢復為野生型p53從而發(fā)揮其轉錄激活下游靶基因的功能。

他?。煌蛔僷53；凋亡

野生型p53是一個腫瘤抑制因子，在細胞應激反應中發(fā)揮重要作用。突變或功能缺失的p53會導致細胞周期失調，基因組不穩(wěn)定，對應激信號產生抗性，最終導致腫瘤的發(fā)生〔1〕。研究發(fā)現，腫瘤細胞中p53的突變率約為50%〔2〕。突變p53失去了野生型p53對細胞應激的保護作用。大多數的p53突變都是發(fā)生在DNA結合區(qū)的錯義突變，這直接導致DNA不能正確與之結合并破壞其轉錄活性。突變p53使得腫瘤細胞獲得對化療的耐藥性，增強細胞生長、代謝和侵入等致癌的新功能〔2〕。正常細胞中野生型p53主要通過MDM2的泛素化途徑降解。同樣，在腫瘤細胞中突變p53由于細胞應激反應而積累。因此，野生型p53在細胞中積累而抑制腫瘤，突變p53積累使腫瘤細胞產生獲得性功能而促腫瘤發(fā)生。以突變p53為靶點的抗腫瘤藥物的研究中，一方面是使突變p53部分或全部恢復野生型p53功能，并激活其下游蛋白PUMA、p21、NOXA等的表達，從而發(fā)揮與野生型p53相似的抗腫瘤活性〔3，4〕。他汀藥物作為一種3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，可降低膽固醇和抑制類異戊二烯的合成，不僅用于治療心血管疾病，還可以用于治療類風濕關節(jié)炎、骨質疏松和腫瘤〔5〕。然而，其具體的抗腫瘤作用機制仍不清楚。本研究初步探討他汀藥物中的美伐他汀和辛伐他汀在具有突變p53背景的人結腸癌HT29(R273H)細胞中的抗腫瘤作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結腸癌HT29細胞購自中科院上海細胞庫；美伐他汀(mevastatin)和辛伐他汀(simvastatin)購自Sigma公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；MTT購自Sigma公司；DMSO(溶解藥物)購自Amresco公司；DMSO(溶解甲瓚)購自Coolaber公司；熱休克蛋白(HSP)90、p53抗體購自Santa公司；PARP抗體購自CST公司；PUMA抗體購自Abcam公司；p21抗體購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人結腸癌HT29細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗 取生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，血球計數板計數，按照一定的細胞密度接種到96孔板中(不同的細胞設置不同的接種密度)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；一種他汀藥物設置5個濃度梯度(0.1、1、10、50、100 μmol/L)3個復孔，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)；每孔加入5 mg/ml的MTT溶液25 μl，放置于培養(yǎng)箱中4 h；吸棄懸液加入150 μl DMSO，置搖床上振蕩10 min；于酶聯免疫檢測儀490 nm波長下測定OD值。根據測定的OD值計算出IC50值和細胞的相對存活率。

1.2.3 Western印跡實驗 藥物處理后的細胞用細胞刮刮下并收集細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，用1×PBS清洗1次，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對細胞樣品進行電泳，電泳結束后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃過夜，用1×TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫2 h。用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。

2 結 果

2.1 美伐他汀和辛伐他汀對細胞增殖的影響 辛伐他汀IC50為(24.99±0.70)μmol/L，美伐他汀IC50為(39.95±3.81)μmol/L。從細胞存活率曲線圖中可以直觀地看出隨著藥物濃度的增加，HT29細胞的存活率逐漸降低(圖1)。提示他汀藥物可抑制具有突變p53背景細胞的增殖。

圖1 他汀藥物對HT29細胞存活率的影響

2.2 美伐他汀和辛伐他汀對p53下游蛋白表達的影響 美伐他汀和辛伐他汀處理HT29后隨著濃度的增加細胞中突變p53蛋白表達水平并沒有明顯改變。同時，可與突變p53形成穩(wěn)定復合體的HSP90蛋白表達水平也沒有改變(圖2)。但是，p53下游靶蛋白PUMA和p21隨著濃度梯度的增加表達水平上升(圖3)。提示他汀藥物可能是通過恢復野生型p53的活性，進而激活p53下游凋亡相關的PUMA和細胞周期相關的p21的表達而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖2 他汀藥物對HT29細胞突變p53和HSP90表達的影響

圖3 他汀藥物對HT29細胞p53信號通路相關蛋白 PUMA和p21表達的影響

2.3 美伐他汀和辛伐他汀對PARP蛋白表達的影響 根據MTT實驗的結果，設置濃度梯度和時間梯度處理HT29細胞后進行Western印跡實驗。結果顯示，隨著濃度和時間梯度的增加，美伐他汀和辛伐他汀均能誘導PARP蛋白的切割(圖4)。提示他汀藥物可促進具有突變p53背景的細胞凋亡的發(fā)生。

圖4 他汀藥物對HT29細胞PARP蛋白表達的影響

3 討 論

不同的胞內應激信號會導致p53信號通路的激活，使p53參與到翻譯的調節(jié)中并發(fā)揮其腫瘤抑制功能〔6〕。在大多數人類腫瘤中的一個共同特征是p53發(fā)生突變或p53信號通路紊亂而導致p53功能缺失。75%的突變導致表達的p53蛋白失去其野生型的功能并對殘存的野生型p53存在負顯性調節(jié)〔7〕。并且，突變p53獲得原癌基因功能對野生型p53并不依賴〔8〕。已經有研究表明，50%的人類癌癥中都會發(fā)生p53突變〔9〕。因此，通過作用于突變p53(降解突變p53或恢復為野生型p53)進行抗腫瘤研究具有非常好的前景。

他汀類作為一種治療心血管疾病的藥物，同樣也可用于抗腫瘤的治療中。Murtola等〔10〕對24 723例前列腺癌治療病例分析后發(fā)現，患者使用阿托伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀后可明顯降低高級前列腺癌發(fā)生的風險。Lakha等〔11〕分析603例結腸癌患者，其中309例使用他汀，294例不使用他汀，發(fā)現他汀可明顯延長病人的生存期，還可降低向高級轉化的風險。在其他高發(fā)性癌癥中，對肺癌的治療效果很差，對乳腺癌的治療效果取得不錯的進展。

本實驗結果發(fā)現，美伐他汀和辛伐他汀對突變p53和HSP90的表達并無明顯影響，但是p53下游的靶蛋白PUMA、p21表達上調，凋亡相關蛋白PARP也發(fā)生切割。PUMA、p21是p53信號通路下游的靶蛋白，可以參與到凋亡和細胞周期的調控。PARP是存在于多數真核細胞中的一個多功能蛋白質翻譯后修飾酶，也是細胞凋亡核心成員caspase的切割底物，因此它在DNA損傷修復和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。從蛋白水平的實驗結果推測，他汀藥物處理HT29細胞后可能導致細胞凋亡和細胞周期阻滯的發(fā)生。提示他汀藥物可能通過恢復p53的部分或全部功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。最新研究發(fā)現，他汀藥物可通過作用于突變p53發(fā)揮其抗癌功能。Di Agostino等〔12〕研究發(fā)現，他汀藥物可破壞突變p53/YAP/NF-Y在細胞核中形成的復合體，使YAP釋放到細胞質中，減少Cyclin A、Cyclin B和CDK1的蛋白表達水平，抑制含突變p53腫瘤細胞的生長。Parrales等〔13〕通過高通量篩選證實他汀藥物可特異性抑制表達突變p53的腫瘤細胞的生長，他汀通過抑制甲羥戊酸-5-焦磷

酸的合成，削弱突變p53和HSP40的相互作用，誘導突變p53通過CHIP介導的泛素化途徑降解而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

總之，本實驗采用p53突變的HT29細胞初步觀察到美伐他汀和辛伐他汀可抑制細胞的增殖。在此基礎上，采用不同濃度的藥物處理，發(fā)現p53下游相關蛋白PUMA、p21的表達增強，凋亡相關蛋白PARP發(fā)生切割。提示他汀藥物抑制HT29細胞增殖的作用機制是通過恢復p53對下游蛋白的調控功能進而誘導細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。

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2 Muller PA，Vousden KH.Mutant p53 in cancer：new functions and therapeutic opportunities〔J〕.Cancer Cell，2014；25(3)：304-17.

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4 Zhang S，Zhou L，Hong B，etal.Small-molecule NSC59984 restores p53 pathway signaling and antitumor effects against colorectal cancer via p73 activation and degradation of mutant p53〔J〕.Cancer Res，2015；75(18)：3842-52.

5 Stryjkowska-Gora A，Karczmarek-Borowska B，Gora T，etal.Statins and cancers〔J〕.Contemp Oncol (Pozn)，2015；19(3)：167-75.

6 Matusewicz L，Meissner J，Toporkiewicz M，etal.The effect of statins on cancer cells〔J〕.Tumour Biol，2015；36(7)：4889-904.

7 Petitjean A，Mathe E，Kato S，etal.Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype：lessons from recent developments in the IARC TP53 database〔J〕.Hum Mutat，2007；28(6)：622-9.

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9 Parrales A，Iwakuma T.Targeting oncogenic mutant p53 for cancer therapy〔J〕.Front Oncol，2015；5：288.

10 Murtola TJ，Tammela TL，Lahtela J，etal.Cholesterol-lowering drugs and prostate cancer risk：a population-based case-control study〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007；16(11)：2226-32.

11 Lakha F，Theodoratou E，Farrington SM，etal.Statin use and association with colorectal cancer survival and risk：case control study with prescription data linkage〔J〕.BMC Cancer，2012；12：487.

12 Di Agostino S，Sorrentino G，Ingallina E，etal.YAP enhances the pro-proliferative transcriptional activity of mutant p53 proteins〔J〕.EMBO Rep，2016；17(2)：188-201.

13 Parrales A，Ranjan A，Iyer SV，etal.DNAJA1 controls the fate of misfolded mutant p53 through the mevalonate pathway〔J〕.Nat Cell Biol，2016；18(11)：1233-43.

〔2016-11-28修回〕

(編輯 曲 莉)

The effect and mechanism of statins on p53 mutant tumor cells

MOU Han-Chuan,YANG Zhi-Kuan,BAO Ya-Feng,etal.

Lab of Molecular Genetics of Aging and Tumor,Faculty of Medicine,Kunming University of Science and Technology,Kunming,650500,Yunnan,China

Objective To explore the effect of statins on p53 mutant tumor cells and the underlying molecular mechanism.Methods The human mutant p53 colon cancer cells HT29(p53 mutant)were in vitro cultured. Cell proliferation was tested by MTT method. The expression of molecular chaperones HSP90,p53 target genes PUMA and p21,apoptosis-related protein PARP were measured by Western blot.Results Statins significantly inhibited the proliferation of HT29 cells,treatment with mevastatin exhibited an IC50 value of (39.95±3.81)μmol/L,the simvastatin exhibited an IC50 value of (24.99±0.70) μmol/L.Compared with those of control group,the protein expressions of mutant p53 and HSP90 were not affected,but statins significantly upregulated the protein expressions of PUMA,p21,and PARP.Conclusions Statins could inhibit the growth of HT29 cells,upregulation of p53 target genes PUMA and p21,but had no effect on the expression of mutant p53,demonstrates that it is possible to restore p53 responses in p53 mutant cells.

Statin;Mutant p53;Apoptosis

國家自然科學基金(81560601)；云南省自然科學基金項目(2014FD011)

張繼虹(1972-)，女，教授，碩士生導師，主要從事分子藥理學及抗腫瘤藥物機制研究。 劉 靜(1987-)，女，講師，碩士生導師，主要從事腫瘤藥理學和靶向抗腫瘤藥物機制研究。

牟漢川(1992-)，男，碩士，主要從事腫瘤藥理學研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0788-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.004