劉大凱 王罡 趙鋼 遲曉飛

脊髓損傷是周圍神經損傷, 是臨床常見病之一, 嚴重影響了人類健康及生活質量, 不同程度的的損傷主要由于外傷所致［1］, 目前臨床治療缺乏特效藥物, 加快周圍神經再生的速度一直是基礎和神經研究工作者的研究目標［2］。血府逐瘀, 湯為活血化瘀中藥, 由桃仁、紅花、當歸、川芎、生地、白芍、丹參、牛膝等構成, 宜疏通督脈, 活血化瘀。有研究顯示, 血府逐瘀湯能夠使兔實驗性頸髓急性損傷神經元周圍水腫減輕, 白質腫脹減輕, 有明顯微血管再通, 細胞凋亡減少作用［3］。本實驗旨在通過研究血府逐瘀湯含藥血清對背根神經元的保護作用來探討血府逐瘀湯的作用機理, 為中醫(yī)藥治療脊髓損傷提供可靠地理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h的SD大鼠(由實驗動物中心提供)10只, 雌雄不限, 體質量為5～8 g。

1.2 主要實驗試劑及設備 血府逐瘀血清(醫(yī)院自行配置)、蛋白酶(GIBCO公司)、高糖型DMEM/F12培養(yǎng)基、NGF(Invitrogen公司)、鼠尾膠(杭州生友生物技術有限公司)、胎牛血清(PAA公司)、逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 背根神經元分離及培養(yǎng) 在無菌的狀態(tài)下, 用乙醚將10只大鼠麻醉后, 切開背部皮膚, 打開錐板, 解剖顯微鏡下取出背根神經, 放于4℃清洗液后, 剪成1 mm3的碎塊, 移入0.25%的胰蛋白酶的離心管中, 37℃培養(yǎng)箱中進行消化,消化15 min后向試管中加入FBS終止消化并吹打成細胞懸液, 離心10 min, 離心速度為1000 r/min后棄上清, 加入培養(yǎng)基, 將細胞懸液移入未包被的25 cm2的培養(yǎng)瓶中, 37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h。取未貼壁細胞懸液于另一離心試管中,調節(jié)細胞濃度為2.5×105個/ml, 分別在包被好鼠尾膠原的96孔的細胞板中。24 h后全量換液, 48 h后加入阿糖胞苷,終濃度為2.5 μg/ml, 繼續(xù)培養(yǎng)背根神經元。

1.3.2 建立細胞損傷模型 將培養(yǎng)5 d的神經元取出, 吸去培養(yǎng)液, 換上亞硫酸鈉(濃度為0.3 mol/L)的培養(yǎng)基, 放置在37℃, 5%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 復氧2 h后開始按2、6、12、24、48 h時間點收集細胞上清進行相關的實驗。

1.3.3 實驗分組及藥物干預 ①空白對照組：正常培養(yǎng)7 d不進行缺氧損傷；②損傷對照組：建立細胞缺氧損傷模型,在缺氧損傷前24 h給予磷酸緩沖試劑(0.01 mol/L)約10 μl；③空白血清組：建立細胞缺氧損傷模型, 細胞種植3 d后入空血清約10 μl, 1%為最終的濃度；④含藥血清組：建立細胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入含藥血清(最佳濃度為1.0×10-10mol/L)約10 μl ；⑤神經營養(yǎng)因子保護組：建立細胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入NGF (濃度為 1%)約 10 μl。

1.4 觀察指標及評價標準 ①MDA的測定：MDA含量=(測定管吸光度-標準空白管吸光度) ×標準品濃度/(標準管吸光度-標準空白管吸光度), MDA可以反映脂質的過氧化程度, 間接反映細胞損傷程度。②SOD的測定：SOD 活力=(對照吸光度值-測定吸光度值)×2×反應體系倍數/對照吸光度值；SOD可以清除超氧陰離子自由基, 保護細胞受損。③LDH的測定：LDH活力=(測定管OD值-測定空管OD值)×標準濃度×2 μmol/ml×1000 ml/(標準管OD值-標準空白管OD值)。LDH生高代表有大量細胞死亡。④MTT法檢測細胞的存活率, 存活率=(每組試驗組光密度值-空白對照組光密度值)/(陰性對照組光密度值-空白對照組光密度值)×100%；MTT法檢測最終產物越少表明細胞死亡或不活躍, 相反說明細胞越活躍。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組MDA含量比較 空白對照組MDA在各個時間點的變化不大, 損傷對照組是各組中同時間點MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對照組, 比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組SOD活力比較 空白對照組各個時間點SOD含量變化不大。同時間點含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時間點含藥血清組與神經營養(yǎng)因子保護組SOD含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 各組LDH活力比較 損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 但與神經營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表 3。

表1 各組MDA的含量測定比較(±s, nmol/ml)

表1 各組MDA的含量測定比較(±s, nmol/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對照組 1.268±0.028 1.284±0.076 1.559±0.009 2.003±0.019含藥血清組 1.249±0.086 1.279±0.102 1.785±0.043 2.865±0.006空白血清組 1.268±0.072 1.320±0.056 2.236±0.072a 3.698±0.048a損傷對照組 1.456±0.069 1.782±0.089 2.863±0.059a 3.765±0.037a神經營養(yǎng)因子保護組 1.272±0.043 1.283±0.027 1.630±0.038 2.378±0.081

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對照組 75.30±3.28 70.24±2.08 68.68±3.37 65.45±3.05含藥血清組 60.94±3.08 52.24±3.10 38.89±3.39 31.69±3.49空白血清組 41.20±2.32a 26.01±3.25a 20.19±2.01a 18.76±3.95a損傷對照組 35.92±3.69a 22.63±3.01a 18.56±2.89a 16.97±3.23a神經營養(yǎng)因子保護組 62.75±4.82 53.35±3.61 39.60±3.00 32.56±3.42

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 24 h 48 h空白對照組 375.30±17.68 487.74±17.08含藥血清組 545.34±20.08 892.24±17.90空白血清組 660.20±21.32a 1167.61±23.25a損傷對照組 782.22±20.09a 1152.63±20.01a神經營養(yǎng)因子保護組 489.75±18.84 675.35±20.34

2.4 各組 MTT法檢測細胞存活率 空白對照組細胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細胞存活率為(0.529±0.010),空白血清組細胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對照組細胞存活率為(0.221±0.034)、神經營養(yǎng)因子保護組細胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對照組, 與神經營養(yǎng)因子保護組及空白對照組較為接近。

3 討論

脊髓損傷后軸突的再生和修復是醫(yī)學界的一大難題。近10年間, 一系列作用于不同發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物已經相繼用于動物實驗和臨床, 其中部分已被證明有減輕或阻止繼發(fā)損傷、保留和促進脊髓功能恢復的作用［4］。

中藥治療繼發(fā)脊髓損傷主要以舒筋活血, 扶正固本為主,大致可分為中藥復方及中藥提取物兩大類。在脊髓損傷早期治宜疏通督脈, 活血化瘀。大量研究表明中藥三七、丹參、人參、黃芪等有助于改善微循環(huán)、抗氧自由基, 減輕脊髓繼發(fā)性損傷, 抑制成纖維細胞增生, 還可興奮脊髓, 促進神經細胞和神經纖維的再生［5-10］。

本實驗通過測量比較各組MDA含量及SOD、LDH活力, 并采用 MTT法檢測細胞的存活率, 觀察血府逐瘀血清對大鼠背根神經元缺氧損傷的保護作用, 結果顯示, 空白對照組MDA在各個時間點的變化不大, 損傷對照組是各組中同時間點MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對照組, 比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?？瞻讓φ战M各個時間點SOD含量變化不大。同時間點含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時間點含藥血清組與神經營養(yǎng)因子保護組SOD含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 但與神經營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?？瞻讓φ战M細胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細胞存活率為(0.529±0.010), 空白血清組細胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對照組細胞存活率為(0.221±0.034)、神經營養(yǎng)因子保護組細胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對照組, 與神經營養(yǎng)因子保護組及空白對照組較為接近。說明血府逐瘀血清對大鼠背根神經元缺氧損傷具有保護作用, 可以促進神經元的生長。

［1］ 時素華, 李志剛, 秦麗娜, 等.脊髓損傷相關信號通路及中醫(yī)藥治療研究.北京中醫(yī)藥, 2014, 33(4):308-310.

［2］ 劉陽, 呂德成, 張衛(wèi)國, 等.滋補脾陰方藥血清、他克莫司及其聯(lián)合應用對大鼠背根神經元生長的影響.中國脊柱脊髓雜志, 2009, 19(4):294-297.

［3］ 韓振宏.血府逐瘀湯加味治療糖尿病周圍神經病變療效觀察.上海醫(yī)藥, 2014, 35(8):33-34.

［4］ 李倩, 尹厚民.血府逐瘀湯加減聯(lián)合穴位貼敷治療糖尿病周圍神經病變臨床觀察.浙江中西醫(yī)結合雜志, 2014, 24(5):423-425.

［5］ 胡才彪.雞矢藤環(huán)烯醚萜苷含藥血清對體外培養(yǎng)新生大鼠背根神經節(jié)神經元的影響.安徽醫(yī)科大學, 2011.

［6］ 王超, 梁曉春, 楊丹, 等.筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經節(jié)神經元氧化應激及UCP3、IGF-1表達的影響.世界中西醫(yī)結合雜志, 2017, 12(6):769-773.

［7］ 孫青, 梁曉春, 張宏, 等.筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)背根神經節(jié)神經元氧化應激及細胞凋亡的影響.中成藥, 2013,35(7):1390-1395.

［8］ 劉偉, 梁曉春.糖尿病周圍神經修復再生中雪旺細胞的作用及中藥對其影響的研究.中國中西醫(yī)結合雜志, 2016, 36(8):1021-1024.

［9］ 李沿江, 黃英如, 冼華, 等.川芎嗪預處理促進大鼠坐骨神經異體移植后神經再生實驗研究.中草藥, 2015, 46(8):1178-1183.

［10］ 舒暢.血府逐瘀湯對重型顱腦損傷患者損傷修復及神經內分泌調節(jié)的影響.河南中醫(yī), 2017, 21(7):1210-1212.