向慶偉, 劉進進, 彭 朗, 劉 煜

(湖北省中醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，湖北 武漢，430061)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)?？梢l(fā)糖尿病患者神經(jīng)性潰瘍、肢端疼痛，嚴(yán)重時可導(dǎo)致截肢[1-2]。高糖可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，造成脊髓背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，是DPN發(fā)生的主要病理機制[3-4]。線粒體功能障礙與認知障礙、DPN等多種神經(jīng)疾病密切相關(guān)，抑制線粒體分裂，可緩解糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)軸突損傷[5-6]。Ras同源基因家族成員A(RhoA)/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)調(diào)控炎癥及線粒體分裂過程，下調(diào)通路蛋白表達，可抑制炎癥，減弱線粒體斷裂，促使神經(jīng)細胞存活，改善順鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變[7-8], 因而RhoA/ROCK可作為減輕背根神經(jīng)元線粒體分裂的潛在作用靶點。當(dāng)歸四逆湯能降低促炎因子表達，抑制炎癥[9-10], 聯(lián)合甲鈷胺應(yīng)用，可減輕糖尿病引發(fā)的神經(jīng)功能受損，對DPN具有明顯療效，但其藥理機制如今尚不清楚。本研究通過體外高糖培養(yǎng)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠背根神經(jīng)元，探討當(dāng)歸四逆湯含藥血清對線粒體分裂及RhoA/ROCK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

SD大鼠購自武漢云克隆動物有限公司 [生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2018-0021], 當(dāng)歸四逆湯(當(dāng)歸9 g、桂枝9 g、芍藥9 g、細辛3 g、甘草6 g、通草6 g、大棗5枚)購自北京同仁堂，葡萄糖、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Neurobasal培養(yǎng)基、B27細胞培養(yǎng)添加劑購自Gibco公司(貨號15023021、C11995500BT、21103049、17504-044), 胰蛋白酶、100×青霉素-鏈霉素溶液、特級胎牛血清、100×L-谷氨酰胺溶液購自上海生工生物工程股份有限公司(貨號A600626-0005、E607011、E600001-0500、E607004100X), 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司(貨號CT0045), CCK-8細胞活力檢測試劑盒、活性氧(ROS)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)測試盒、白細胞介素-18(IL-18)測試盒、RIPA裂解液(高強度)、總蛋白定量測定試劑盒(BCA法)購自南京建成生物工程研究所(貨號G021-1-1、E004-1-1、A020-2-2、H007、H015、W062-1-1、A045-4-2); 兔源β-actin抗體、兔源ROCK抗體、兔源RhoA抗體、兔源動力相關(guān)蛋白1(Drp1)抗體、兔源分裂蛋白1(Fis1)抗體、兔源絲裂原融合蛋白1(MFN1)抗體、兔源絲裂原融合蛋白2(MFN2)抗體購自Abcam公司(貨號ab227387、ab45171、ab187027、ab184247、ab229969、ab221661、ab124773等)。酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Science公司(型號MultiskanTMFC), 發(fā)光成像儀購自德國Healthcare公司(型號LAS 4000), 全能蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司(型號Trans-Blot Turbo等)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備及大鼠背根神經(jīng)元體外培養(yǎng): 當(dāng)歸四逆湯煎制后過濾，獲得生藥含量2.2 g/mL的藥液，取6只大鼠以12 mL/kg的劑量灌胃給藥[11], 另取6只大鼠灌胃等劑量生理鹽水(模型組)[12]。7 d后取大鼠頸動脈血, 4 000轉(zhuǎn)/min離心10 min, 分離得到含藥血清和正常血清, 56 ℃水浴滅活0.5 h, 0.22 μm過濾滅菌后，分裝保存于-80 ℃環(huán)境中。取正常SD大鼠1只，麻醉后處死，剝離脊髓，取出兩側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，剪碎后以胰酶消化20 min, 吹打后200目過篩，得到單細胞懸液, 12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 以培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液)重懸細胞沉淀后計數(shù)，密度調(diào)為1×106個/mL, 接種培養(yǎng)6 h, 更換為神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基+1%谷氨酰胺+2% B27細胞培養(yǎng)添加劑+1%青霉素-鏈霉素溶液)，每3 d半量換新的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基，細胞長至80%后，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組處理及材料收集: 取傳代培養(yǎng)的背根神經(jīng)元，將其隨機分為對照組、高糖組、當(dāng)歸四逆湯組，高糖組與當(dāng)歸四逆湯組細胞以45 mmol/L的高糖處理24 h, 然后當(dāng)歸四逆湯組細胞以10%的含藥血清處理[12], 對照組與高糖組血清正常處理, 24 h后收集各組細胞和培養(yǎng)液。

1.2.3 檢測各組細胞活力: 取傳代培養(yǎng)的背根神經(jīng)元，以1×105個/mL的密度接種在96孔板，按照1.2.2中方法分組處理細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，另取6個孔(不接種細胞)作空白組，加入CCK-8處理，采用酶標(biāo)儀測量450 nm波長下各孔吸光度(A), 計算細胞活力，細胞活力=[(模型組和當(dāng)歸四逆湯組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)]×100%。

1.2.4 測定各組細胞ROS水平及其釋放的LDH、IL-6、IL-18水平: 取出分組處理后收集的背根神經(jīng)元細胞，冰水浴下經(jīng)RIPA裂解液裂解，離心收集上清液，取0.15 mL, 采用試劑盒測出各組細胞ROS水平，剩余細胞蛋白樣品液進行蛋白檢測。取出分組處理后收集的背根神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)液，離心后以試劑盒測出上清液中LDH、IL-6、IL-18的水平。

1.2.5 測定各組細胞線粒體膜電位: 取傳代培養(yǎng)的背根神經(jīng)元，接種在12孔板，按照1.2.2中方法分組處理細胞，使用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位，具體操作參照說明書進行，以酶標(biāo)儀測定的紅色熒光/綠色熒光的比值表示線粒體膜電位水平。

1.2.6 檢測各組細胞線粒體分裂蛋白、融合蛋白及RhoA/ROCK通路蛋白表達水平: 取出測定ROS水平后剩余的各組細胞蛋白樣品液，總蛋白濃度經(jīng)BCA法測量后，將其煮沸變性，每組分別取含20 μg總蛋白的樣品液加入上樣孔中，電泳后濕轉(zhuǎn)(110 V, 1.5 h), 以3%牛血清白蛋白溶液封閉硝酸纖維膜上蛋白，剪取蛋白Drp1、Fis1、MFN1、MFN2、RhoA、ROCK、β-actin條帶，經(jīng)對應(yīng)一抗孵育后洗膜，經(jīng)二抗孵育后洗膜，通過化學(xué)發(fā)光劑顯色，以發(fā)光成像儀拍照，條帶灰度值以Image J軟件定量分析，最終得出各蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間進一步比較行LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元細胞活力的影響

與對照組(100.00%)比較，高糖組[(42.75±7.46)%]大鼠背根神經(jīng)元細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組[(86.83±12.05)%]背根神經(jīng)元細胞活力升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元ROS水平及釋放LDH水平的影響

與對照組比較，高糖組背根神經(jīng)元ROS水平及其釋放的LDH水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組背根神經(jīng)元ROS水平及其釋放的LDH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠背根神經(jīng)元ROS水平及釋放的LDH水平比較

2.3 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元釋放IL-6、IL-18水平的影響

與對照組比較，高糖組背根神經(jīng)元釋放的IL-6、IL-18水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組背根神經(jīng)元釋放的IL-6、IL-18水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)元釋放IL-6、IL-18水平

2.4 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元線粒體膜電位的影響

對照組大鼠背根神經(jīng)元線粒體膜電位為(3.23±0.51), 高糖組為(2.14±0.37), 當(dāng)歸四逆湯組為(3.25±0.34)。與對照組比較，高糖組大鼠背根神經(jīng)元線粒體膜電位降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組大鼠背根神經(jīng)元線粒體膜電位升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元線粒體分裂蛋白及融合蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組大鼠背根神經(jīng)元線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1表達升高，融合蛋白MFN1、MFN2表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組大鼠背根神經(jīng)元線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1表達水平降低，融合蛋白MFN1、MFN2表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

A: 對照組; B: 高糖組; C: 當(dāng)歸四逆湯組。圖1 免疫印跡檢測各組大鼠背根神經(jīng)元線粒體分裂蛋白及融合蛋白表達

表3 各組大鼠背根神經(jīng)元線粒體分裂蛋白及融合蛋白相對表達水平

2.6 當(dāng)歸四逆湯含藥血清對高糖培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組背根神經(jīng)元RhoA/ROCK通路蛋白RhoA、ROCK表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與高糖組比較，當(dāng)歸四逆湯組背根神經(jīng)元RhoA/ROCK通路蛋白RhoA、ROCK表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表4。

A: 對照組; B: 高糖組; C: 當(dāng)歸四逆湯組。圖2 免疫印跡檢測各組大鼠背根神經(jīng)元RhoA/ROCK通路蛋白表達

表4 各組大鼠背根神經(jīng)元RhoA/ROCK通路蛋白相對表達

3 討 論

線粒體動力學(xué)損傷及功能障礙與DPN的發(fā)病密切相關(guān)，高糖環(huán)境可增強背根神經(jīng)元產(chǎn)生并積累ROS, 促使線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1的表達，抑制線粒體融合蛋白MFN的表達，破壞線粒體分裂與融合的動力學(xué)平衡，引起線粒體分裂過強，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進而造成視覺功能障礙、DPN等神經(jīng)疾病[13-15]。本研究以高糖培養(yǎng)SD大鼠背根神經(jīng)元，模擬DPN的致病過程，結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)能顯著升高大鼠背根神經(jīng)元ROS水平，促進大鼠背根神經(jīng)元釋放LDH、IL-6及IL-18, 促進Drp1及Fis1蛋白的表達，顯著降低細胞活力、線粒體膜電位、細胞MFN1及MFN2蛋白表達，表明高糖可誘導(dǎo)ROS及促炎因子大量產(chǎn)生釋放，促使線粒體分裂，引發(fā)線粒體功能損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元活力降低，基本符合DPN在細胞水平上的致病過程。

DPN的治療以控制血糖、補充神經(jīng)營養(yǎng)為主，療效并不理想，且隨著社會發(fā)展，居民攝入營養(yǎng)過剩, DPN發(fā)病率越來越高，因此有效預(yù)防其發(fā)生和發(fā)展是迫切需要解決的臨床難點[1-2, 16]。中醫(yī)學(xué)將DPN歸屬于“血痹”“痿證”等范疇，脈絡(luò)瘀滯痹阻、氣血虧虛不暢是其主要病機。當(dāng)歸四逆湯是《傷寒論》中的溫經(jīng)散寒代表方劑，可補血散瘀、溫經(jīng)通脈、振陽祛寒，廣泛應(yīng)用于坐骨神經(jīng)痛、DPN、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的臨床治療?，F(xiàn)代藥理研究[9-10, 17-18]表明，當(dāng)歸四逆湯可降低促炎因子水平，抑制炎癥反應(yīng)，顯著改善DPN患者的臨床癥狀，但目前還沒有關(guān)于其藥理機制的準(zhǔn)確闡述。研究[7-8, 19]發(fā)現(xiàn)，小G蛋白RhoA及其下游激酶ROCK在DPN的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，高糖可促進RhoA、ROCK表達，引發(fā)炎癥，進而上調(diào)Drpl的表達，增強線粒體分裂，導(dǎo)致背根神經(jīng)元損傷凋亡，抑制RhoA/ROCK通路激活，減輕炎癥，下調(diào)Drp1表達，緩解線粒體斷裂，阻斷線粒體凋亡途徑，維持神經(jīng)細胞正常生長及代謝，緩解神經(jīng)病變癥狀，因而推測下調(diào)RhoA/ROCK通路可能是當(dāng)歸四逆湯治療DPN的作用機制。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯含藥血清處理高糖培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)元，可顯著降低背根神經(jīng)元的ROS水平，增高LDH、IL-6及IL-18水平和細胞中Drp1、Fis1、RhoA及ROCK蛋白表達，顯著提升細胞活力、線粒體膜電位，增高細胞中MFN1及MFN2蛋白的表達，表明當(dāng)歸四逆湯可抑制RhoA/ROCK信號的激活，減少ROS和炎性因子產(chǎn)生釋放，阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)生，減輕線粒體分裂，促使背根神經(jīng)元存活，改善高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷。

綜上所述，當(dāng)歸四逆湯可下調(diào)RhoA及ROCK蛋白的表達，抑制ROS和炎性因子合成釋放，阻止炎癥發(fā)生及進展，減弱線粒體分裂過程，提高高糖培養(yǎng)的背根神經(jīng)元活力，減輕細胞損傷，在細胞水平上證實了對DPN的防治功效，值得臨床推廣使用。抑制RhoA/ROCK通路激活可能是當(dāng)歸四逆湯治療DPN的藥理機制，后續(xù)會進行回復(fù)實驗對其進行深入探討。