趙錦慧+周琳

摘要：對洋蔥進行活化培養(yǎng)，探討鈉離子不同誘導濃度與時間對洋蔥鱗莖內表皮細胞程序性死亡的影響。結果表明：隨著鈉離子誘導濃度的升高及誘導時間的延長，細胞形狀和結構均會發(fā)生不同程度的變化，細胞凋亡數目增加，細胞中丙二醛含量上升，且細胞凋亡率及丙二醛含量在不同處理間均差異顯著。說明鈉離子在一定誘導濃度與時間下，對洋蔥鱗莖內表皮細胞形態(tài)、結構、細胞凋亡率、丙二醛含量均有不同程度的影響。

關鍵詞：鈉離子；洋蔥；細胞程序性死亡；細胞凋亡率；丙二醛

中圖分類號： Q942 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0189-02

20世紀90年代初國際上才把細胞程序性死亡（PCD）概念引入到植物學，隨后有關研究遍布植物發(fā)育生物學、植物生理學等各個領域[1-5]。PCD和細胞凋亡意義相同，均屬于細胞生理性死亡，它貫穿高等植物生長發(fā)育的一生，具有重要的生命意義。

中國每年的農作物和瓜果蔬菜都會受到各種逆境因子不同程度的影響，因此對植物的抗逆性機制及調控進行研究，既有理論意義又有實際應用價值。鹽脅迫是植物經常遇到的逆境之一，Katsuhara研究發(fā)現鹽脅迫誘導的大麥根部細胞凋亡表現出典型的凋亡特征[6]，揭示了根部細胞凋亡可能是植物抗鹽脅迫的一種生理機制。本試驗選用洋蔥鱗莖內表皮作為材料，對鈉離子不同誘導濃度及誘導時間下洋蔥細胞程序性死亡現象進行研究，主要觀察凋亡細胞在形態(tài)學上發(fā)生的變化，并統計細胞凋亡率及測定細胞中丙二醛含量。旨在探索鈉離子不同處理濃度及處理時間誘導洋蔥細胞程序性死亡的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

市售隔年洋蔥。

1.2 試劑

0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L氯化鈉溶液、PBS緩沖液、改良苯酚品紅染液、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸等。

1.3 試驗方法

1.3.1 洋蔥的預處理 取隔年洋蔥，室溫下于清水中培養(yǎng) 2～3 d，每天換水，直到露出幼嫩的白根，表明洋蔥已被活化。

1.3.2 細胞程序性死亡觀察 取活化后的洋蔥鱗莖，切取約1 cm2的內表皮若干，分成3組進行處理。第1組是正對照，在PBS緩沖液中處理1 h；第2組是鈉離子誘導組，分別用0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl誘導1、4 h；第3組是負對照，在沸水中處理5 min。各組處理結束后，將洋蔥鱗莖內表皮用改良苯酚品紅染液染色10～15 min，染色完成后制成玻片標本，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。選擇染色效果好、背景干凈、細胞分散良好的視野進行拍照，并對凋亡細胞進行計數統計。細胞凋亡率=凋亡細胞數/視野中觀察的細胞總數×100%。每個處理觀察3個玻片標本，細胞凋亡率用3個視野統計的平均值表示。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測定 參照劉萍等的方法[7]，用硫代巴比妥酸法測定細胞中丙二醛（MDA）含量，測定時設置3個重復，最終含量用平均值表示。

1.3.4 數據統計分析 采用Excel 2003對實驗數據進行作圖，運用SPSS 16.0統計軟件，在95%水平上進行One-Way ANOVA分析處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 對照組細胞形態(tài)結構觀察

圖1顯示，正對照組細胞輪廓清晰，細胞之間的界限分明，細胞膜完整無損，細胞質透明，背景干凈，細胞核呈球形。負對照組細胞輪廓及細胞之間的界限消失，細胞膜、細胞壁完全裂解，部分細胞核也發(fā)生裂解并且其形狀和位置均發(fā)生一定變化，細胞質內出現碎末狀物質，背景不干凈，細胞不能保持結構的完整。

2.2 不同濃度鈉離子誘導1 h后細胞程序性死亡觀察

圖2顯示，不同濃度Na+誘導1 h后，隨著Na+濃度的增加，細胞輪廓及細胞之間的界限逐漸模糊，質壁分離程度加深，形狀及位置發(fā)生變化的細胞核增多，細胞質內出現的碎末狀或塊狀物質越來越多，細胞背景不干凈。

2.3 不同濃度鈉離子誘導4 h后細胞程序性死亡觀察

圖3顯示，不同濃度Na+誘導4 h后，細胞形態(tài)特征發(fā)生了更明顯的變化，部分細胞的細胞膜已經破裂，細胞核輪廓模糊，著色變淺，細胞質壁分離現象更明顯，細胞質內塊狀或碎末狀物質更多，細胞背景極不干凈。

2.4 不同濃度鈉離子誘導下洋蔥內表皮細胞凋亡情況

圖4顯示，隨著Na+誘導濃度的增加及誘導時間的延長，細胞凋亡率呈上升趨勢，并且各處理間差異顯著。這說明不同濃度的Na+誘導不同時間對細胞的生命活動產生了不同程度的影響。

2.5 不同處理下洋蔥鱗莖內表皮細胞中丙二醛（MDA）含量的變化

MDA是脂質過氧化物的代謝產物，其生物活性強，化學性質穩(wěn)定，它的含量可以間接反映氧自由基對植物細胞的損傷程度。圖5顯示，Na+誘導組丙二醛含量均高于正對照組，并且A3～A9與A1間均表現出顯著差異。同樣誘導濃度下，隨著誘導時間的延長，MDA含量快速增加；同樣誘導時間下，隨著誘導濃度的增加，誘導時間短時MDA含量增加幅度小，誘導時間長時MDA含量增加幅度大。這說明一定濃度的Na+作用一定時間，會對植物細胞造成明顯傷害，并且Na+誘導時間對丙二醛的產生影響更大。

3 結論與討論

本研究結果表明，正對照組細胞輪廓清晰，形態(tài)正常，結構完整；負對照組細胞輪廓消失，形態(tài)和結構均發(fā)生明顯變化，細胞不能保持完整；Na+誘導組細胞輪廓發(fā)生變化，細胞質壁出現不同程度的分離，細胞核、細胞質、細胞膜等細胞結構發(fā)生不同程度的變化，Na+誘導濃度和時間與細胞凋亡率及細胞中丙二醛含量成正比。

NaCl之所以能夠誘導細胞程序性死亡，其可能機制是：（1）細胞程序性死亡需要大量的ATP，而線粒體是能不斷產生ATP的一種重要的細胞器，位于線粒體外膜上的受體可以被NaCl刺激，導致膜通透性孔不斷保持開放狀態(tài)，最終使得線粒體的膜通透性增強，使細胞色素C、一些凋亡誘導因子等被釋放，從而加快細胞程序性死亡。（2）Na+濃度升高時，膜質過氧化物會在細胞內形成，這會破壞細胞膜上鈣離子與鈉離子的相對平衡狀態(tài)，造成細胞膜上的Ca2+被Na+替換掉，從而改變Ca2+的流向，使得Ca2+由細胞內向細胞外流動，最終導致細胞膜的透性增強，使細胞內的某些凋亡誘導因子等物質被釋放，進而加快細胞程序性死亡。（3）Na+濃度越高，細胞發(fā)生質壁分離的程度越高， 達到一定程度后會導致細胞內液泡裂解，然后液泡中的酸性水解酶等就會被釋放出來，它的釋放可以使細胞內的細胞核、高爾基體、核糖體、細胞膜、線粒體等被分解，細胞結構發(fā)生明顯改變后誘發(fā)了細胞程序性死亡的發(fā)生[7-9]。

目前對PCD有關的基因、PCD 的調節(jié)途徑、各信號分子的調節(jié)機理以及信號分子之間的關系等均獲得了一些了解。但是對洋蔥內表皮細胞發(fā)生PCD時，相關酶和蛋白質之間是怎樣聯系并發(fā)揮作用的還有待進一步研究。

參考文獻：

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