禹 樂綜述,余英豪審校

·綜 述·

非小細(xì)胞肺癌胸腔積液EGFR突變檢測方法的研究進(jìn)展

禹 樂1綜述,余英豪2審校

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的組織學(xué)類型。目前以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)是治療NSCLC最重要的基因靶向治療藥物。用于檢測EGFR基因突變的標(biāo)本來源主要是腫瘤手術(shù)切除組織，但是對于心肺功能較差無法耐受手術(shù)或已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會的NSCLC晚期患者，腫瘤標(biāo)本的獲得往往比較困難。惡性胸腔積液是晚期NSCLC患者常見的癥狀，獲取比較容易。因此利用胸腔積液進(jìn)行EGFR基因突變檢測是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，文章現(xiàn)就EGFR與NSCLC關(guān)系、EGFR基因突變檢測方法、肺癌患者胸腔積液中EGFR基因突變情況等進(jìn)行綜述。

肺癌；胸腔積液；細(xì)胞學(xué)；EGFR基因

肺癌不僅是歐美等發(fā)達(dá)國家發(fā)病與死亡率最高的惡性腫瘤，也已成為我國城市居民死亡率第一的惡性腫瘤，且有逐年上升的趨勢[1-2]，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是最常見的組織學(xué)類型(約占70%～80%)[3]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對腫瘤發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞、分子水平的進(jìn)一步認(rèn)識，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitors, EGFR-TKIs) 在發(fā)生EGFR敏感突變的NSCLC患者的治療中取得了顯著效果[4]。用于檢測EGRF基因突變的最佳標(biāo)本為腫瘤手術(shù)切除組織，其次是腫瘤穿刺組織、纖支鏡活檢組織，但是肺癌缺乏有效的早期診斷手段，70%以上的患者在確診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，從而難以獲得用于檢測EGFR基因突變的組織學(xué)標(biāo)本，而胸腔積液是晚期肺癌患者常見的并發(fā)癥之一[5-6]，胸水標(biāo)本獲取比較簡單、安全，因此利用胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，本文對此作一綜述。

1 EGFR與NSCLC關(guān)系

1.1 EGFR的生物學(xué)特征概況EGFR基因位于人類第七號染色體短臂上(7p12-7p14)，含28個(gè)外顯子，長約118 kb，其轉(zhuǎn)錄形成的mRNA長約5.6 kb，其編碼的表皮生長因子受體屬于酪氨酸激酶受體家族，是分子量為170 kD的跨膜糖蛋白，編碼蛋白由1186個(gè)氨基酸殘基組成，在結(jié)構(gòu)上分為3個(gè)功能區(qū)：細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)。EGFR是傳遞胞外信號到胞內(nèi)的重要途經(jīng)蛋白，其主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PI3K-PDK通路，JAK-STAT通路和PLC-γ通路[7-8]，通過這些途徑，胞外信號將轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號，從而有效應(yīng)對外界的信號刺激，以達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖生長、分化，抑制細(xì)胞凋亡的作用。EGFR基因的突變活化、擴(kuò)增及產(chǎn)物蛋白過表達(dá)均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、血管新生，并且抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，其中以EGFR基因的突變活化為主要機(jī)制[9-10]。

1.2 EGFR在NSCLC中基因突變情況EGFR基因突變或擴(kuò)增的情況在多種腫瘤中存在著家族聚集性，如腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等，其中在肺癌中發(fā)生突變的現(xiàn)象較為常見[11-13]。EGFR基因突變類型已達(dá)到30余種，突變部位主要集中于編碼酪氨酸激酶的第18-21外顯子區(qū)域，約90%的EGFR基因突變集中在外顯子19(delE746-A750，delL747-P753insS)及外顯子21(L858R，L861Q)，全球范圍內(nèi)，exon19/21突變分別占EGFR總突變率的47.6%和34%，中國exon19/21分別占EGFR總突變率的52%和45.3%，且突變多發(fā)生于腺癌、非吸煙者和女性肺癌患者[14-19]。

1.3 EGFR突變與NSCLC的治療 2004年美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員Lynch等[20]及Paez等[21]分別提出EGFR發(fā)生基因突變的NSCLC患者對EGFR-TKIs有高度敏感性，且女性、非吸煙者、腺癌患者、亞洲人群更易發(fā)生EGFR激活突變。目前以EGFR為治療靶標(biāo)的分子靶向治療受到了國內(nèi)外腫瘤界的普遍關(guān)注，其中EGFR酪氨酸激酶抑制劑Iressa(Genfitinib)已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療晚期NSCLC患者，我國也于2005年2月批準(zhǔn)了Iressa進(jìn)入臨床。酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib是一種苯胺喹唑啉化合物，可阻斷EGFR誘導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞的生長[22]?，F(xiàn)有的資料表明，存在EGFR外顯子19、21突變的患者對酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)較好，Gefitinib等小分子靶向藥物可通過抑制ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合，達(dá)到抑制酪氨酸激酶的活化及自動磷酸化進(jìn)而抑制EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到NSCLC患者病灶縮小，生活質(zhì)量提高，生存期延長的效果[20-24]。

2 檢測胸腔積液EGFR基因突變的方法概述

2.1 Sange測序法 70年代末在Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧終止法手動測序之后，80年代中期出現(xiàn)應(yīng)用雙脫氧終止法原理、使用熒光代替同位素及計(jì)算機(jī)圖像識別的自動測序儀。目前，Sange測序法是檢測EGFR基因突變最直觀和最準(zhǔn)確的方法之一，但該技術(shù)對標(biāo)本與技術(shù)條件有著嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，且靈敏度不高，只能檢測突變基因含量大于25%～30%的樣本[25-26]。胸腔積液中的大部分腫瘤突變均為體細(xì)胞突變，突變細(xì)胞往往與野生型細(xì)胞混雜，所以對體細(xì)胞的突變檢測需要較高的特異性和靈敏度。而目前廣泛使用的直接測序法由于靈敏度不高、耗時(shí)較長、費(fèi)用較高，且檢測多處突變位點(diǎn)的能力有限，在臨床篩選基因靶向治療患者上難以大范圍推廣應(yīng)用。

2.2 突變體富集PCR(mutant-enriched PCR, ME-PCR) ME-PCR最早是由Asano等[25]建立用于檢測EGFR基因突變的技術(shù)，其基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)兩次的巢式PCR來擴(kuò)增DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第2次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整的進(jìn)入第2次PCR擴(kuò)增，并得到突變型產(chǎn)物的富集。因經(jīng)過兩次PCR擴(kuò)增，可從1×103～1×104個(gè)野生型拷貝中檢測到1個(gè)EGFR突變基因[22]，其靈敏度和特異性均較高，且成本不高。其不足之處在于只能對已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)對應(yīng)的特異性引物，進(jìn)而檢測一些常見的突變類型，且檢測過程需要兩次PCR，操作步驟繁雜易因污染而造成假陽性，耗時(shí)較長、通量較小，因此有一定的局限性。

2.3 高頻率熔解曲線技術(shù)(high resolution melting analysis，HRM) HRM技術(shù)是近年來備受關(guān)注的創(chuàng)新技術(shù)，理論上是通過研究PCR產(chǎn)物依賴于序列的熔解溫度而對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，進(jìn)而用于檢測樣品中存在的雙鏈DNA的單核苷酸多態(tài)性基因變異，可用于體細(xì)胞突變的檢測和測序前突變的篩選[27]。但該方法只能分析純度單一的小片段DNA，且要求有足夠的PCR模板，模板含量不少于1 ng時(shí)能得到比較穩(wěn)定可靠的結(jié)果。現(xiàn)階段該技術(shù)尚缺少大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，很多檢測項(xiàng)目仍處于開發(fā)研究論證階段，在國內(nèi)尚未大范圍推廣應(yīng)用。

2.4 高效液相色譜法(denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC) DHPLC又稱為溫度調(diào)控高效液相色譜，該技術(shù)最早建立于1995年，近年來迅速發(fā)展。該技術(shù)是由變性梯度凝膠電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的缺失或插入。DHPLC與直接測序法相比具有快速、簡單等特點(diǎn)，不僅可用于已知突變的檢測,還可用于未知突變的掃描，但無法檢測出同源性突變，只能檢測突變是否存在，無法檢測出其突變類型；當(dāng)有多個(gè)片段需要檢測時(shí)，需要多個(gè)解鏈溫度，增加了檢測步驟，增加了工作量，且在結(jié)果判讀時(shí)易出錯(cuò)。

2.5 突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system， ARMS) ARMS又稱等位基因特異PCR，或稱等位基因特異性擴(kuò)增法。該技術(shù)是1989年Newton等[28]在PCR的基礎(chǔ)上建立的，是利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的基本原理，針對不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊镆詸z測出突變基因。設(shè)計(jì)探針時(shí)，在引物的3'端設(shè)計(jì)一個(gè)錯(cuò)配堿基，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，另一個(gè)與野生DNA互補(bǔ)，使其只能與突變型或野生型互補(bǔ)而進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后所得到的PCR產(chǎn)物可通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)或凝膠電泳進(jìn)行分析。由于其高敏感度、高特異性、技術(shù)成熟、易推廣的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種已知基因突變的檢測。

楔形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system，Scorpions ARMS)是將 ARMS 和 Scorpions 實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)相結(jié)合的一種新技術(shù)，該技術(shù)所用的探針為Scorpion 探針是一種新型的探針，由一條引物和一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針構(gòu)成，探針的5'端和3'端分別標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。在自由狀態(tài)時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)很接近，不產(chǎn)生熒光；變性時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，退火時(shí)引物與模板結(jié)合并延伸，環(huán)區(qū)與新合成的目的基因的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，此時(shí)Scorpion探針與PCR產(chǎn)物在同一條DNA鏈上，是分子內(nèi)的結(jié)合。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，因此可檢測到報(bào)告熒光發(fā)出的熒光信號。該技術(shù)自動化程度更高，操作簡單，特異性和靈敏性高，重復(fù)性好，為臨床基因靶向治療提供及時(shí)、可靠的分子病理實(shí)驗(yàn)室依據(jù)[29]。

3 肺癌患者胸腔積液標(biāo)本常用處理方法

胸腔積液的標(biāo)本經(jīng)過常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷可分為：NSCLC陰性、NSCLC可疑陽性、確診為NSCLC三大類。不同類型的標(biāo)本應(yīng)具有最適合的標(biāo)本處理方法，但現(xiàn)有相關(guān)資料只有少數(shù)對其研究對象的標(biāo)本性質(zhì)有所描述，大部分研究的側(cè)重點(diǎn)在于胸腔積液和腫瘤組織的EFGR基因突變檢測結(jié)果的比較，以及EGFR基因突變檢測的意義，鮮有對不同類型的胸腔積液進(jìn)行系統(tǒng)的分類及其相應(yīng)的最適方法的相關(guān)研究。

現(xiàn)對少數(shù)提及標(biāo)本類型的研究結(jié)果總結(jié)如下：常規(guī)細(xì)胞學(xué)就能確診為NSCLC的胸腔積液標(biāo)本可直接使用細(xì)胞沉淀提取DNA,再進(jìn)行EGFR基因突變的檢測，該方法步驟簡單、速度快捷、DNA獲得率高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠；對于腫瘤含量>40%的標(biāo)本還可選擇直接提取上清液中的DNA進(jìn)行檢測[30-32]，僅通過細(xì)胞學(xué)涂片就能明確診斷，且腫瘤細(xì)胞含量>40%的標(biāo)本較少，所以應(yīng)用胸腔積液上清液檢測EGFR的方法雖然可行，但實(shí)際應(yīng)用中局限性也較大。

細(xì)胞學(xué)診斷為可疑或確診為NSCLC的胸腔積液標(biāo)本，均可將細(xì)胞沉淀制作成細(xì)胞塊，該技術(shù)不僅可通過HE切片對可疑腫瘤陽性的標(biāo)本進(jìn)行定性，還可通過免疫組化染色進(jìn)行鑒別診斷，且細(xì)胞沉淀蠟塊可長久保存，解決了脫落細(xì)胞無法保存和連續(xù)切片的問題。細(xì)胞塊中腫瘤含量>5%時(shí)，可應(yīng)用細(xì)胞塊切片進(jìn)行DNA提取，并用于EGFR基因突變檢測[33]。雖然細(xì)胞塊提取法的過程相較于細(xì)胞沉淀直接提取法繁瑣，腫瘤細(xì)胞DNA的質(zhì)量和獲得率等不足，但因其檢測結(jié)與腫瘤組織檢測結(jié)果具有較高的一致性，且檢測結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，并兼?zhèn)湓\斷功能等優(yōu)點(diǎn)，使其已成為目前臨床病理處理胸腔積液標(biāo)本的最主要技術(shù)方法?，F(xiàn)階段對于如何較好的處理腫瘤含量<5%胸腔積液標(biāo)本的方法尚需要進(jìn)一步研究。

4 肺癌患者胸腔積液中EGFR基因突變情況

4.1 胸腔積液上清液檢測EGFR基因突變 臨床送檢的胸腔積液經(jīng)過常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，選擇診斷為胸水中見到腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本，離心后取上清液用于EGFR基因突變檢測。早期Kimura等[34]檢測了43例NSCLC患者的胸腔積液的上清液的EGFR基因突變情況，研究結(jié)果顯示突變率為25.6%(11/43)。Soh等[35]檢測61例NSCLC患者的胸腔積液上清液的EGFR基因突變率為26.2%(16/61)，兩者較為接近。潘羨心等[30]分別用直接測序法和HMR法檢測了43例肺腺癌患者癌性胸水上清液標(biāo)本，結(jié)果顯示HRM法檢測EGFR基因突變共17例，總突變率為39.53%，其中第19外顯子突變14例，第21外顯子突變3例；直接基因測序結(jié)果顯示，EGFR突變14例，總突變率為32.56%，均為第19 外顯子突變。Zhang等[36]比較了26例NSCLC患者胸腔積液中上清液和細(xì)胞沉淀的突變情況，直接測序法結(jié)果顯示突變率為26.92%(7/26)，有四對樣本存在差異，兩者檢測結(jié)果符合率為53.85%；突變富集PCR檢測結(jié)果顯示兩者的突變率均為50%(13/26)，兩者檢測結(jié)果符合率為100%。上述為數(shù)不多的研究結(jié)果顯示，胸腔積液的上清液可作為檢測EGRF基因突變的標(biāo)本來源，但由于尚缺少大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證和方法學(xué)的統(tǒng)一，胸腔積液上清液檢測EGFR基因突變有待進(jìn)一步研究論證。

4.2 胸腔積液細(xì)胞沉淀檢測EGFR基因突變 臨床送檢的胸腔積液經(jīng)過常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，選擇腫瘤細(xì)胞陽性的標(biāo)本，經(jīng)離心后獲取的細(xì)胞沉淀可直接用于DNA提取，還可進(jìn)行石蠟包埋制作細(xì)胞塊后進(jìn)行DNA提取，最后行EGFR基因突變檢測。丁麗等[37]采用Sanger測序法檢測NSCLC患者的惡性胸腔積液23例，EGFR突變率為34.8%(8/23), 19外顯子突變占50%，21外顯子突變占20%。謝強(qiáng)等[38]采用ARAMS法同時(shí)檢測NSCLC患者內(nèi)科胸腔鏡活檢標(biāo)本和與其相對應(yīng)患者的胸腔積液63例，活檢標(biāo)本和胸腔積液標(biāo)本中EGFR突變率分別為54.0%、50.8%，胸腔積液細(xì)胞沉淀的EGFR基因突變率略低于活檢組織標(biāo)本。趙瑾等[33]采用焦磷酸測序法檢測NSCLC患者胸腔鏡下活檢標(biāo)本46例和與其相對應(yīng)患者的胸腔積液43例EGFR基因突變，活檢標(biāo)本和胸腔積液標(biāo)本中EGFR基因突變檢出率分別27.9% (12/43) 和25.6% (11/43)。魏冰等[39]采用RT-PCR法同時(shí)檢測惡性胸腔積液中的細(xì)胞沉淀及其每例患者所對應(yīng)的纖維支氣管鏡或經(jīng)肺穿刺活檢晚期標(biāo)本各109例，EGFR基因突變率為56.88%(62/109),其中19外顯子突變占到53.23%(33/62)，21外顯子突變占46.77%(29/62)，胸腔積液內(nèi)的細(xì)胞標(biāo)本檢出率略高于活檢組織標(biāo)本，但無明顯差異。尹迎春等[40]采用RT-PCR檢測76例NSCLC的胸水細(xì)胞塊及對應(yīng)的肺腫瘤穿刺標(biāo)本的EGFR突變，結(jié)果兩者的EGFR突變率均為34.21%(26/76)，一致率100%。現(xiàn)有研究資料顯示，胸腔積液離心后獲取沉淀，提取DNA后進(jìn)行EGFR突變檢測，使用不同的方法所獲得的EGFR基因突變率在25.6%～68.4%之間，突變主要發(fā)生在21號外顯子和19號外顯子上，其中21號外顯子的點(diǎn)突變(L858R)約占總突變率的18%～52%，19號外顯子上缺失(19Del)約占到總突變率的48%～81%[33，37-42]；突變率與肺癌的病理類型有關(guān)，其中腺癌患者胸腔積液沉淀的EGFR突變率普遍高于其他類型的肺癌，這與腫瘤組織標(biāo)本檢測EGFR突變率、突變熱點(diǎn)部位及臨床特點(diǎn)較一致[43]，但在EGFR基因突變率與性別、吸煙史、年齡的相關(guān)性上各研究結(jié)果略有不同，尚未形成較為一致的結(jié)論。

5 結(jié) 語

目前我國NSCLC患者的EGFR基因突變檢測率不高，難以取得滿意的檢測標(biāo)本是主要原因之一。臨床中推薦應(yīng)用腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測，但是對于心肺功能較差無法耐受手術(shù)或已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會的NSCLC晚期患者，組織標(biāo)本的獲得比較困難。因此尋找替代腫瘤組織用于基因診斷是當(dāng)前迫切需要解決的問題。惡性胸腔積液是晚期NSCLC患者常見的癥狀，獲得較為容易。應(yīng)用胸腔積液不僅可進(jìn)行常規(guī)的病理診斷，還為實(shí)施EGFR基因突變檢測提供了可能。隨著分子病理技術(shù)的不斷進(jìn)步和胸腔積液處理方法的不斷完善，應(yīng)用胸腔積液檢測EGFR基因突變將會成為了解NSCLC患者EGFR基因突變狀況的又一可靠途徑，以期為臨床篩選適合應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑治療的患者提供參考價(jià)值。

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(本文編輯：劉玉巧)

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(10MA076);南京軍區(qū)聯(lián)勤第十八分部青年培育項(xiàng)目(18FBQN2015008);福建漳州市科技局資助項(xiàng)目(Z2011066);解放軍第175醫(yī)院科研基金(16Y020)

1.363000漳州,解放軍第175醫(yī)院病理科；2.350025福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科

余英豪，E-mail：yuyinghao0808@126.com

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R734.2

A

1672-271X(2017)04-0380-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.04.012

2017-04-10；

2017-06-29)