李鑫，郝林*，馬玲

(1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西省晉中市衛(wèi)生學校，山西榆次030600）

解淀粉芽孢桿菌HRH317抑菌物質發(fā)酵條件的優(yōu)化

李鑫1,2，郝林1*，馬玲1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西省晉中市衛(wèi)生學校，山西榆次030600）

該試驗研究解淀粉芽孢桿菌HRH317抑菌物質的發(fā)酵條件。首先采用單因素試驗研究發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量及菌齡、搖床轉速、裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響，然后采用正交設計對這7個因素進行篩選，分析極差結果確定接種菌齡、接種量、發(fā)酵時間為影響抑菌圈大小的3個關鍵因素，在此基礎上，采用Box-Behnken設計及響應面進行分析，在發(fā)酵溫度37℃、初始pH7.0、搖床轉速150 r/min、裝液量30 mL/100 mL條件下，確定菌株HRH317抑菌物質的最佳發(fā)酵條件為接種菌齡21 h、接種量3.8%、發(fā)酵時間25.5h。擬合試驗模型結果顯示，抑菌活性物質的抑菌圈直徑大小從未優(yōu)化前的18.63mm提高至22.95mm，抑菌圈大小增加23.19%。

解淀粉芽孢桿菌；抑菌物質；發(fā)酵條件；優(yōu)化

目前食品防腐劑的開發(fā)正在由化學合成食品防腐劑向天然食品防腐劑方向發(fā)展，由單項防腐向廣譜防腐[1-2]方向發(fā)展。因此，以動植物或微生物的代謝產(chǎn)物為原料，生產(chǎn)天然生物食品防腐劑受到重視。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣性很高的細菌，屬于芽孢桿菌屬，因芽孢桿菌易于發(fā)酵，且會將抑菌蛋白分泌到胞外，抑菌蛋白又有性質穩(wěn)定、水溶性等優(yōu)點，便于應用微生物制劑[3]。解淀粉芽孢桿菌在其自身的生長過程中產(chǎn)生一系列低分子質量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性代謝產(chǎn)物，抑制多種植物病原菌的生長[4]。

本試驗研究以解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）HRH317為研究對象，通過單因素法和響應面設計試驗，優(yōu)化發(fā)酵條件，從而得到該菌株抑菌物質的最優(yōu)發(fā)酵條件，為今后工業(yè)化生產(chǎn)[5]該抑菌物質提供真實可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌HRH317、指示菌青霉（Penicilliumsp.）：山西農(nóng)業(yè)大學食品學院生物工程系。

種子培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：按照參考文獻[6]的方法配制；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，NaCl 0.5 g，吐溫20 0.1 g，MgSO40.075 g，水100 mL。

1.2 儀器與設備

5804R型離心機：德國Eppendorf公司；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京光明醫(yī)療儀器廠；DFZ-05恒溫干燥箱：北京醫(yī)療機械廠；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限責任公司；HZQ-QX全溫振蕩搖床：哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 操作要點

種子液的制備：將活化的HRH317斜面菌種接于液體種子培養(yǎng)基，裝液量30 mL/100 mL，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h得到液體搖瓶種子。

發(fā)酵液的制備：將種子液按1%（V/V）的接種量接于裝液量為30 mL/100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

上清液的制備：發(fā)酵液于4 000 r/min、4℃離心20 min，即得發(fā)酵上清液，4℃保存待用。

指示菌菌懸液的制備：取一環(huán)青霉斜面菌種，接于無菌生理鹽水中，配制成孢子懸液濃度為106個/mL，備用。

1.3.2 單因素試驗

發(fā)酵時間：取菌種HRH317，菌齡為24 h，接種量按種子液的1%接入到初始pH=7的7個發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量均為30 mL/100 mL，于37℃、150 r/min分別培養(yǎng)0、12 h、24 h、36 h、48h、60 h、72 h后，進行抑菌活性和菌體生長量測定。

發(fā)酵溫度：取菌種HRH317，菌齡為24 h，接種量按種子液的1%接入5個初始pH為7的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量均為30 mL/100 mL，分別在22℃、27℃、32℃、37℃、42℃條件下150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間參照以上最優(yōu)結果，分別進行抑菌活性和菌體生長量測定。

初始pH：在8個發(fā)酵培養(yǎng)基中，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液分別將初始pH值調至3、4、5、6、7、8、9、10，滅菌后待用。取菌齡為24 h的菌株HRH317，接種量按種子液的1%接入以上發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量均為30 mL/100 mL，恒溫振蕩150 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵時間和溫度均參照以上最優(yōu)結果，分別進行抑菌活性和菌體生長量測定。

接種量：挑取菌齡24 h的菌株HRH317，裝液量均為30 mL/100 mL，接種量分別按種子液的0.5%、1%、2%、3%、4%、5%接于6個發(fā)酵培養(yǎng)基中，于150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度及初始pH均參照以上最優(yōu)結果，分別進行抑菌活性和菌體生長量測定。

接種菌齡：取等量的菌齡分別為12 h、16 h、20 h、24 h、28 h的菌株HRH317，后分別接入5個發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量均為30 mL/100 mL，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量均參照以上最優(yōu)結果，分別進行抑菌活性和菌體生長量測定。

裝液量：取菌種HRH317接入6個發(fā)酵培養(yǎng)基中，100 mL三角瓶中裝液量分別為15mL、30mL、45mL、60mL、75mL、 90 mL，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量及菌齡均參照以上最優(yōu)結果，分別對抑菌活性和菌體生長量進行測定。

搖床轉速：將菌株HRH317接入5個發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉速分別為0、50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min，發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量及菌齡、裝液量均參照以上最優(yōu)結果，后分別進行抑菌活性和菌體生長量測定。

1.3.3 響應面法優(yōu)化主要發(fā)酵條件

通過設計7因素2水平L8（27）正交試驗確定3個影響發(fā)酵條件的主要因素，后采用Box-Behnken回歸試驗設計，以抑菌圈直徑（Y）大小作為響應值通過響應面進行分析來確定菌株HRH317抑菌物質的最優(yōu)發(fā)酵條件，試驗設計因素與水平見表1、表2。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 測定方法

細菌菌體生長量的測定：采用平板計數(shù)法，37℃倒置培養(yǎng)24 h后計菌落數(shù)。

上清液抑菌活性的測定：發(fā)酵上清液抑菌活性的測定采用牛津杯法[7]，用抑菌圈直徑大小表示。每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.1 Effect of fermentation time on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

由圖1可知，發(fā)酵初期菌體生長處于延緩期，繁殖少；隨發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)增多，24 h活菌數(shù)達到高峰，活菌數(shù)對數(shù)值為11.95，發(fā)酵液抑菌活性最強，抑菌圈直徑最大達19.95 mm。后進入穩(wěn)定期，有害代謝產(chǎn)物積累及營養(yǎng)物質消耗增多，活菌數(shù)減少，抑菌活性也隨之減弱。因此選擇發(fā)酵時間24 h進行后續(xù)試驗。

2.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

圖2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

由圖2可知，隨發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液活菌數(shù)與抑菌活性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。37℃是該菌株生長最適溫度，此時活菌數(shù)最多，對數(shù)值為11.42，抑菌活性也達到高峰，抑菌圈直徑最大為19.84 mm。溫度過高對菌體生長代謝及酶活力均有影響，抑菌活性與菌株產(chǎn)量逐漸下降。因此選擇發(fā)酵溫度37℃進行后續(xù)試驗。

2.1.3 發(fā)酵液初始pH對抑菌活性和菌株生長的影響

圖3 初始pH對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

培養(yǎng)基中pH值會影響細胞代謝酶活性和營養(yǎng)物質的離子化程度，進而影響微生物生長代謝[12-13]。由圖3可知，當初始pH值為3～4時，菌體利用營養(yǎng)物質較弱生長代謝慢，抑菌活性相對較弱；初始pH值為5～8時，HRH317菌株生長較好，此范圍內發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性較強，pH為7時抑菌圈直徑最大為19.93 mm，此時活菌數(shù)對數(shù)值是9.79。酸性或堿性過強都會不同程度抑制細菌的生長[8]。因此選擇初始pH值為7進行后續(xù)試驗。

2.1.4 接種量對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

圖4 接種量對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

由圖4可知，隨接種量的增加，發(fā)酵液抑菌活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，活菌數(shù)一直緩慢增加。接種量為4%時，發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性達到高峰，此時抑菌圈直徑達最大為20.10 mm，活菌數(shù)對數(shù)值為9.48；接種量5%時活菌數(shù)雖有增加，但菌體之間競爭營養(yǎng)和空間更激烈，不能正常生長，導致抑菌活性明顯下降。因此選擇接種量為4%進行后續(xù)試驗。

2.1.5 接種菌齡對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

圖5 接種菌齡對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.5 Effect of inoculation age on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

發(fā)酵過程中菌齡過短，菌體生長代謝緩慢，抑菌物質產(chǎn)量少；菌齡過長，菌體可能會變異、自溶，代謝停滯，抑菌活性物質產(chǎn)量下降[14-15]。由圖5可知，菌齡為16～20 h時菌株產(chǎn)量穩(wěn)定，20 h時細菌生長代謝旺盛，抑菌活性和活菌量均達到最大，抑菌圈直徑為22.32 mm，活菌數(shù)對數(shù)值是8.52；接種菌齡超過20 h則二者均有所下降。因此選擇接種菌齡為20 h進行后續(xù)試驗。

2.1.6 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

由圖6可知，菌株生長量和抑菌物質的活性對通氣量的要求基本一致。當裝液量為30mL/100mL時抑菌效果最優(yōu)，抑菌圈直徑為20.23mm，活菌數(shù)對數(shù)值是10.47。繼續(xù)增加裝液量，通氣量逐漸減少，細菌活菌數(shù)量和抑菌效果都呈下降趨勢。因此選擇裝液量為30mL/100mL進行后續(xù)試驗。

圖6 裝液量對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.6 Effect of liquid volume on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

2.1.7 搖床轉速對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響

圖7 搖床轉速對發(fā)酵液抑菌活性和菌株生長的影響Fig.7 Effect of shaker rotation speed on antibacterial activity of fermentation broth and strain growth

轉速過低，通氣量小，不利于菌體生長；轉速過高，可能會引起菌體自溶[9-10]。過低或過高轉速都不利于發(fā)酵。由圖7可知，搖床轉速為150 r/min時抑菌效果最好且滿足發(fā)酵所需溶氧量，抑菌圈直徑為22.32 mm，活菌數(shù)對數(shù)值為9.62。因此選擇搖床轉速為150 r/min進行后續(xù)試驗。

2.2 主要發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 主要影響因素的確定

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表3可得，影響抑菌圈直徑大小的因素由強到弱依次為：接種菌齡、接種量、發(fā)酵時間、裝液量、搖床轉速、初始pH、發(fā)酵溫度，則影響抑菌物質產(chǎn)量的主要因素為接種菌齡、接種量及發(fā)酵時間。將其余4個影響因素分別固定在各自單因素的最佳水平上，即發(fā)酵溫度37℃、pH7、裝液量30 mL/100 mL、搖床轉速150 r/min。

2.2.2 響應面優(yōu)化分析

綜合以上試驗結果，依據(jù)表2的Box-Behnken Design試驗因素與水平[11]對其進行優(yōu)化，結果見表4。

表4 Box-Behnken Design試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of Box-Behnken Design

根據(jù)通過Minitab軟件對表4進行回歸擬合，回歸方程為

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

由表5可知，模型F=35.13，P＜0.01說明模型極顯著；P失擬＞0.05，失擬項不顯著。相關系數(shù)R2=0.984 4，調整復相關系數(shù)R2Adj=0.976 3，說明該模型擬合程度較好，誤差小，可預測和分析HRH317發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的發(fā)酵條件。一次項A、C二次項A2、B2及交互項AC對抑菌圈直徑Y值的影響表現(xiàn)出極顯著水平（P＜0.01），交互項AB、BC不具有顯著水平的影響。試驗可得各因素對抑菌圈直徑的影響C＞A＞B，即發(fā)酵時間＞接種菌齡＞接種量。

2.2.3 響應面分析與發(fā)酵條件優(yōu)化

圖8 接種量、發(fā)酵時間、接種菌齡相互作用對菌株HRH317發(fā)酵產(chǎn)物抑菌圈直徑影響的響應曲面及等高線圖Fig.8 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,fermentation time and inoculation age on the inhibition zone diameter of fermentation products by strain HRH317

對回歸方程取一階偏導，解得發(fā)酵時間25.65 h、接種量3.75%、接種菌齡21.22 h，將以上值帶入回歸方程，得到抑菌圈直徑預測值為23.31 mm。為方便實際操作，修改條件為發(fā)酵時間25.5 h、接種量3.8%、接種菌齡21 h。此條件下做3次重復，抑菌圈直徑平均為22.95 mm，從試驗值與預測值來看擬合度良好，可證實此回歸方程有效可靠。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗驗證

由表6可知，采用優(yōu)化組合條件對解淀粉芽孢桿菌HRH317進行發(fā)酵，其抑菌物質活性用抑菌圈直徑表示，由優(yōu)化前的18.63 mm提高至22.95 mm，提高了23.19%，表明采用優(yōu)化發(fā)酵條件可以較大提高解淀粉芽孢桿菌HRH317抑菌物質活性。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化前后的結果對比Table 6 Comparison of fermentation results before and after optimization

3 結論

經(jīng)過單因素試驗與響應面設計分析，確定了解淀粉芽孢桿菌HRH317產(chǎn)生抑菌物質的最優(yōu)發(fā)酵條件為接種菌齡21 h、發(fā)酵時間25.5 h、接種量3.8%、裝液量30 mL/100 mL、搖床轉速150 r/min、發(fā)酵pH7、溫度37℃。在此優(yōu)化條件下，解淀粉芽孢桿菌HRH317抑菌圈直徑為22.95 mm，比優(yōu)化前提高了23.19%。

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Optimization of fermentation conditions of antibacterial substances produced by

Bacillus amyloliquefaciensHRH317LI Xin1,2,HAO Lin1*,MA Ling1(1.Institute ofFood Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China; 2.Shanxi JinzhongHealth School,Yuci 030600,China)

The fermentation conditions of antibacterial substances-producingBacillus amyloliquefaciensHRH317were studied.First of all,the effect of fermentation time,temperature,initial pH,inoculum,inoculation age,rotating speed and liquid volume on the antibacterial activity of fermentation broth were researched by single factor experiments.Then the results were optimized by orthogonal experiments,and it determined that the inoculation age,inoculum and fermentation time were the three key factors influencing the inhibition zone diameter.On the basis,the results were analyzed by Box-Behnken design and response surface methodology.At conditions of fermentation temperature 37℃,initial pH 7,rotating speed 150 r/min and liquid volume 30 ml/100 ml,the optimum fermentation conditions of strain HRH317for antibacterial substances production was inoculation age 21 h,inoculum 3.8%and fermentation time 25.5 h.According to the test model,the inhibition zone diameter of antimicrobial substances increased from 18.63 mm to 22.95 mm,increasing by 23.19%.

Bacillusa myloliquefaciens;antibacterial substances;fermentation conditions;optimization

TS201.3

0254-5071（2017）02-0025-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.006

2016-11-04

國家“十二五”科技支撐計劃課題（2012BAD38B07）

李鑫（1988-），女，碩士，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：郝林（1957-），男，教授，博士，研究方向為微生物學。