焦夢涵，劉艷丹，陳 艷，李金福

猬裂頭蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

焦夢涵，劉艷丹，陳 艷，李金福

目的 克隆、表達(dá)猬裂頭蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease ，CP)基因，并分析其生物學(xué)特性。方法 提取蛇源猬裂頭蚴總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因，克隆入pMD-19T載體，測序正確后將27kDa-CP基因亞克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建pET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Transetta(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)目的蛋白27kDa CP。用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western Blotting進(jìn)行分析，并運(yùn)用NCBI和ExPASy等有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具，對(duì)27 CP基因及其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果 CP基因序列的開放閱讀框長為1 011 bp，去除信號(hào)肽序列長954 bp，登錄到GenBank，獲得登錄號(hào)ANA52569。該基因編碼一個(gè)含317個(gè)氨基酸的蛋白多肽，屬于Peptidase_C39_like超家族，理論分子量約35 669.9 Da，等電點(diǎn)5.92。pET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，蛋白在大腸埃希菌中成功表達(dá)，經(jīng)純化后的蛋白利用Western blotting 檢測，證明與預(yù)期大小相符，且與猬裂頭蚴感染陽性血清有較好的結(jié)合反應(yīng)。結(jié)論 成功克隆、表達(dá)了猬裂頭蚴27kDa CP基因，獲知CP基因及其編碼的氨基酸序列和生物信息學(xué)。

猬迭宮絳蟲；裂頭蚴；半胱氨酸蛋白酶基因；原核表達(dá)；生物信息學(xué)

猬裂頭蚴病(plerocercoidosis)是猬迭宮絳蟲中絳期裂頭蚴寄生人體引起，是重要的食源性寄生蟲病。全球約有1 400例病例的報(bào)道，而我國病例的報(bào)道已有千余例，包括27個(gè)省(區(qū)、市)[1]。不僅影響人、獸健康，而且蛙、蛇、豬等經(jīng)濟(jì)飼養(yǎng)動(dòng)物的培育、飼養(yǎng)及產(chǎn)量均會(huì)受到制約，因而受到人們的高度重視[2]。

半胱氨酸蛋白酶是寄生蟲的主要“消化酶”，對(duì)寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的研究主要涉及該酶參與蟲體營養(yǎng)吸收、入侵組織細(xì)胞、免疫逃避、生長發(fā)育及生殖等方面[3-12]。研究發(fā)現(xiàn)，裂頭蚴有3種分子量(53 kDa、21 kDa和27 kDa)的半胱氨酸蛋白酶，其中最重要的參與蟲體入侵及營養(yǎng)吸收的是27 kDa半胱氨酸蛋白酶[13-15]。

Kong Y[16]等對(duì)猬迭宮絳蟲27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因在蟲體不同發(fā)育階段的差異表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，該酶基因在鉤球蚴和裂頭蚴中有表達(dá)，而在未成熟卵和成蟲中不表達(dá)，推測27 kDa半胱氨酸蛋白酶與蟲體的生長及移行有關(guān)。

目前，有關(guān)猬迭宮絳蟲半胱氨酸蛋白酶的研究鮮見報(bào)到，克隆、表達(dá)27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因，分析其生物學(xué)特性，再將其亞克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，為進(jìn)一步討論其功能和免疫篩選蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裂頭蚴 裂頭蚴檢獲于貴州安順地區(qū)野生王錦蛇，通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為猬迭宮絳蟲裂頭蚴。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠10只，20～25 g，雄性，購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(黔)2002-0001。

1.1.3 質(zhì)粒和菌株 pET-28a(+)購置于大連寶生物工程有限公司；pMD-19T克隆載體，購置于大連TaKaRa公司；E.coliDH5α，由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；Transetta(DE3) Chemically Competent Cell，購置于上海生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑 RNAiso Reagent (Total RNA提取試劑)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA快速提取試劑盒、抗His標(biāo)簽抗體、羊抗兔IgG/HRP、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自寶生物大連TaKaRa公司；羊抗小鼠HRP-IgG購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Ni-IDA Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(cat No:69670)為美國Novagen公司產(chǎn)品；其他試劑為國內(nèi)分析純。

1.2 方法

1.2.1 猬裂頭蚴總RNA提取及cDNA合成 總RNA的抽提按照TAKARA公司RNAiso PLUS的說明書進(jìn)行操作?？俁NA經(jīng)電泳檢測，測定A260/280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 根據(jù)NCBI中公布的猬裂頭蚴27 kDa半胱氨酸蛋白酶基因(D63670)序列，運(yùn)用Premier 5.0 和DNAClub軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物如下：SEP-CP-F: 5′-CCGGAATTCTCGACTGAAAGTGA-3，帶EcoRI酶切位點(diǎn)(下畫線處)；SEP-CP-R:5′-CGGAAGCTTTTACACGGTTGGAT-3′，帶HindⅢ酶切位點(diǎn)(下畫線處)。以貴州蛇源的猬裂頭蚴總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、 59 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,凝膠回收試劑盒回收DNA。

1.2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-19T-27kDa-CP 回收27kDa-CP基因的PCR產(chǎn)物，克隆入pMD-19T載體，連接轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)菌，篩選陽性菌落。將PCR鑒定陽性的菌液按照質(zhì)粒抽提試劑盒抽提，提取的重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。所得序列與NCBI D63670序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定其同源性。

1.2.4 構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a(+)-27kDa-CP 將測序正確的pMD-19T-27kDa-CP質(zhì)粒和pET-28a(+)表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)菌中，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落，PCR和雙酶切鑒定后，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的重組子命名為pET-28a(+)-27kDa-CP。

1.2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取重組菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素,終濃度100 μg/mL)中，于37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u振誘導(dǎo)表達(dá)5 h。將上述處理的1 000 mL菌液于4 ℃，12 000 r/min，離心2 min，收集菌體，棄去上清。裂解緩沖液重懸菌體(4 mL/g濕菌)，反復(fù)凍融3次后，超聲裂解，4 ℃ 13 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀。用SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 目的蛋白的純化透析 沉淀經(jīng)含2 mol/L和4 mol/L尿素的洗滌緩沖液反復(fù)洗滌后，按1 mL 加入1.5 mL含8 mol/L尿素的平衡洗滌緩沖液，重懸，3 h或冰浴過夜，4 ℃，16 000 r/min，離心30 min，收集上清。按Ni-IDA Agarose 純化試劑盒純化，用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白。收集鎳柱純化后的洗脫液，在PBS緩沖液中4 ℃透析20以上，其間更換4～5次透析液，用12%SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 感染小鼠血清制備 用檢獲的猬裂頭蚴經(jīng)口感染小鼠10只，每只感染裂頭蚴5條，于感染2周后眼球取血，血置于離心管中室溫下放置2 h，再置4℃冰箱過夜，待血液凝固收縮后，4 000×g離心10 min，即獲感染小鼠血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 重組蛋白的Western blotting分析 一抗采用兔來源的抗His 標(biāo)簽的單抗(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體(1∶2 000)。將重組蛋白27kDa-CP經(jīng)12%SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，進(jìn)行Western blotting 分析。一抗為猬裂頭蚴感染小鼠血清(1∶100)，二抗為羊抗小鼠HRP-IgG(1∶2 000)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后單蒸水終止反應(yīng)。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System, ExPASy, http://ca.expasy.org/)提供的生物信息學(xué)工具分析猬迭宮絳蟲裂頭蚴CP基因的特點(diǎn)；運(yùn)用NCBI Blast對(duì)cNDA序列進(jìn)行同源比對(duì)，用ProtParam分析蛋白等電點(diǎn)、分子質(zhì)量；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；利用EMBL-EBI的在線分析工具InterProScan分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域以及活性位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增獲得的27kDa-CP基因長約1 000 bp，與預(yù)期大小基本相符,見圖1。

M：DNA標(biāo)志物(DL2000)；1：27kDa-CP PCR 產(chǎn)物M: DNA marker(DL2000); 1: PCR product of 27kDa-CP 圖1 猬迭宮絳蟲裂頭蚴27kDa-CP基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of 27 kDa-CP gene of Spirometra erinacei pleroceroid

2.2 重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定 pET-28a(+)27kDa-CP重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，以及酶切產(chǎn)物經(jīng)鑒定，條帶與理論值完全吻合(見圖2)。重組質(zhì)粒測序顯示，相應(yīng)的插入序列與目的基因cDNA序列一致，有3個(gè)位點(diǎn)突變，即96、277、296位氨基酸，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將測序后的序列登陸到GenBank，獲得的登錄號(hào)ANA52569。

M：DNA標(biāo)志物(DL2000)；1：27kDa-CP PCR 產(chǎn)物；2：27kDa-CP PCR 產(chǎn)物(去信號(hào)肽)；3：pET-28a(+)；4：pET-28a(+)-27kDa-CP PCR 產(chǎn)物；5：pET-28a(+)-27kDa-CP單酶切；6：pET-28a(+)-27kDa-CP雙酶切(EcoRI和HindⅢ)M: DNA marker (DL2000); 1: PCR Product of 27kDa-CP; 2: PCR Product of 27kDa-CP (no signal peptide); 3: pET-28a(+); 4: PCR product of recombinant pET-28a(+)-27kDa-CP; 5: pET-28a(+)-27kDa-CP digested by single enzyme; 6: pET-28a(+)-27kDa-CP digested by EcoRI and HindⅢ圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)27kDa-CP的PCR和酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-28a(+)27kDa-CP by PCR and digestion with restriction enzymes

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約35 kDa處出現(xiàn)一明顯的蛋白條帶，而重組菌在誘導(dǎo)前，空載菌在誘導(dǎo)前、后均未出現(xiàn)該蛋白條帶。蛋白既有可溶性表達(dá)，也有包涵體表達(dá)，主要是包涵體表達(dá)(見圖3)。將洗脫液透析后濃縮，測得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.065 mg/mL。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1：pET-28a(+)未誘導(dǎo)；2：pET-28a(+)誘導(dǎo)；3： pET-28a(+)-27kDa-CP未誘導(dǎo)；4： pET-28a(+)-27kDa-CP誘導(dǎo)；5：pET-28a(+)-27kDa-CP誘導(dǎo)后上清；6：pET-28a(+)-27kDa-CP誘導(dǎo)后沉淀；7：純化后的重組蛋白(箭頭)M：Protein marker; 1：pET-28a(+) without IPTG induction; 2：pET-28a(+) with IPTG induction; 3：pET-28a(+)-27kDa-CP without IPTG induction; 4：pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction;5：Supernatant of pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction; 6：Precipitation of pET-28a(+)-27kDa-CP with IPTG induction; 7：Purification recombinant protein(arrow)圖3 重組蛋白27kDa-CP的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein 27 kDa-CP

2.4 純化蛋白的Western blotting分析 Western blotting結(jié)果顯示，重組菌誘導(dǎo)后在Mr約為35 kDa處有被組氨酸(His)單克隆抗體識(shí)別的條帶。重組蛋白可被猬裂頭蚴感染的小鼠血清識(shí)別，在Mr35 kDa處出現(xiàn)特異條帶(圖4)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1、2、3：猬裂頭蚴鼠抗血清M：Protein marker；1、2、3：Mouse antiserum of Spirometra erinacei plerocercoid圖4 重組蛋白27kDa-CP 的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of recombinant protein 27 kDa-CP

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1 基本理化性質(zhì) 用DNAMAN分析軟件對(duì)猬裂頭蚴27 kDa CP的去信號(hào)肽編碼cDNA序列進(jìn)行分析，該序列長度為954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，理論分子量約為35 669.9 Da，等電點(diǎn)約為5.92，屬于酸性蛋白。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為33.64，低于域值40，說明該蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。疏水?dāng)?shù)為71.07，總親水性-0.454，蛋白質(zhì)總體疏水性較高。

2.5.2 27 kDa CP的編碼cDNA序列的TA克隆及測序序列比對(duì)分析 將所得PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA克隆，挑選陽性單克隆測序。運(yùn)用NCBI Blast對(duì)測序后的cDNA序列與NCBI(D63670)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示同源性為99%，有13個(gè)堿基突變，與目的基因序列基本一致。

2.5.3 BLAST分析 通過NCBI的Blastn在線分析工具比對(duì)分析，結(jié)果顯示27 kDa CP的編碼cDNA屬于Peptidase_C39_like超家族,見圖5。

2.5.4 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用ExPASy中InterProScan在線分析預(yù)測，27 kDa CP功能結(jié)構(gòu)域有2個(gè)分別位于第13位到第73氨基酸和第102位到第316位氨基酸之間的序列，Peptidase C1A家族的功能結(jié)構(gòu)域一般在第10位到第317位氨基酸之間,見圖6。

圖5 Blastn中27 kDa-CP基因同源性分析Fig.5 Homology analysis of 27 kDa-CP gene in Blastn

圖6 27kDa-CP結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Domains prediction for 27 kDa-CP

3 討 論

半胱氨酸蛋白酶廣泛地存在于人類、寄生蟲等多種動(dòng)物體內(nèi)。在寄生蟲生活史中起關(guān)鍵作用，目前研究主要涉及該酶參與蟲體的入侵、移行、營養(yǎng)吸收和免疫逃避等多個(gè)方面。

Sogorb MA等通過對(duì)衛(wèi)氏并殖吸蟲的研究發(fā)現(xiàn)，CP能降解結(jié)締組織的主要成分，表明CP有利于蟲體對(duì)宿主組織的破壞和易于蟲體的入侵及移行[17]。Berasain P等證明了肝片吸蟲組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶1，2能通過降解宿主細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜分子，促進(jìn)寄生蟲自身移動(dòng)[18]。Kong Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)猬迭宮絳蟲裂頭蚴分泌的27 kDa CP通過將IgG裂解成Fab和Fc片段參與該蟲的免疫逃避。最近，余長茂對(duì)廣州管圓線蟲3種半胱氨酸蛋白酶(Ac-CathB-1、Ac-CathB-2、Ac-Hem)進(jìn)行了組織定位研究，發(fā)現(xiàn)Ac-CathB-1和Ac-CathB-2在一期幼蟲到成蟲的消化系統(tǒng)均有分布，其中在成蟲腸道上皮微絨毛層的分布更為集中，推測Ac-CathB-1 和Ac-CathB-2可能參與蟲體的營養(yǎng)攝取[19]。

本研究通過NCBI的Blastn在線分析，27 kDa CP的編碼cDNA屬于Peptidase_C39_like超家族。Peptidase_C39_like超家族在細(xì)菌、古生菌、原生動(dòng)物、真菌、植物、動(dòng)物及病毒中均有發(fā)現(xiàn)。Peptidase C1A家族包含許多肽鏈內(nèi)切酶和一些外肽酶，催化類型和半胱氨酸蛋白酶一致，而27 kDa CP基因的結(jié)構(gòu)預(yù)測與Peptidase C1A家族的蛋白結(jié)構(gòu)類似，說明27 kDa CP可能具有半胱氨酸蛋白酶的催化活性。

對(duì)猬迭宮絳蟲27 kDa CP進(jìn)行克隆表達(dá)和純化，所獲重組蛋白的分子量與理論值相似。分子量約為35 kDa，與從蟲體提取純化得到的天然半胱氨酸蛋白酶(27 kDa)在分子量上不一致，其原因可能是在原核表達(dá)時(shí)，未發(fā)生真核體內(nèi)表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄后加工過程，產(chǎn)生的重組蛋白實(shí)際上是半胱氨酸蛋白酶前體[20]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，猬裂頭蚴皮層可溶性蛋白經(jīng)SDS-PAGE共分離出12條蛋白帶，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)范圍在98～178 kDa，其中Mr24.5、35、50、170 kDa為高豐度蛋白區(qū)帶。經(jīng)Wester Blotting分析，2條帶(Mr15和35 kDa)為猬裂頭蚴皮層特異性蛋白條帶，能被感染小鼠血清識(shí)別。本次重組蛋白經(jīng)Western blotting分析，也在Mr35 kDa處出現(xiàn)特異蛋白條帶，可被裂頭蚴感染血清識(shí)別。推測猬裂頭蚴皮層是半胱氨酸蛋白酶主要表達(dá)的部位，這與裂頭蚴的入侵、移行和營養(yǎng)的攝取等有一定的關(guān)系。另外，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將為進(jìn)一步研究猬裂頭蚴半胱氨酸蛋白酶的功能及尋找猬裂頭蚴的診斷抗原奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning, expression and bioinformatics analysis of 27 kDa cysteine protease gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid

JIAO Meng-han, LIU Yan-dan, CHEN Yan, LI Jin-fu

(DepartmentofParasitology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

To clone and express 27 kDa cysteine protease (CP) gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid, and analyze the biology characteristics, a total of RNA was extracted from the plerocercoids and reversely transcribed into cDNA. The 27kDa-CP gene was amplified by PCR and cloned into pM-19T vector for sequencing. The accurate sequence was subcloned into the expression vector pET-28a (+). The recombinant plasmid was transformed into Transetta (DE3) and the expression protein induced by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni2+ affinity chromatography, and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The 27 kDa CP gene and its expression protein were predicted and analyzed by bioinformatics analysis tools such as NCBI and ExPASy. Results showed that the ORF length of 27 kDa CP gene sequence was 1 011 bp, and the removed signal peptide sequence was 954 bp with the submission number of ANA52569 in GenBank. The whole sequence of 27 kDa CP (Mr 35 669.9, pI 5.92) was 317 amino acids conferred from cDNA, which belongs to the Peptidase_C39_like superfamily. The pET-28a (+)-27kDa-CP was expressed under the induction of IPTG. Western blotting analysis showed that the purified protein reach expectancy, and had better response with positive serum ofSpirometraerinaceiplerocercoid infection. In conclusion, the 27 kDa CP gene ofSpirometraerinaceiplerocercoid is successfully cloned and expressed and knowing coded sequences and bioinformatic.

Spirometraerinacei; pleroceroid; cysteine protease gene; prokaryotic expression; bioinformatics

Chen Yan, Email: chenyan757@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.006

，陳艷，Email:chenyan757@sina.com

貴州醫(yī)科大學(xué)人體寄生蟲學(xué)教研室,貴陽 550004

R383

A

1002-2694(2017)02-0120-06

2016-07-28 編輯： 李友松

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(No.20143024)資助

Supported by the Science and Technology Department of Guizhou Province (No. 2014-3024)