楊 珍，尼 博，田莉莉，范偉興

半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒別布魯氏菌感染抗體和S2、Rev.1免疫抗體的研究與應(yīng)用

楊 珍，尼 博，田莉莉，范偉興

目的 布魯氏菌病嚴(yán)重威脅著我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全，現(xiàn)有的常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法雖具有較高的敏感性與特異性，但無法區(qū)分布魯氏菌感染抗體和S2、Rev.1疫苗免疫抗體(以下簡(jiǎn)稱“鑒別診斷”)，給我國(guó)執(zhí)行撲殺布病感染動(dòng)物的政策帶來阻力。 因此在S2和Rev.1疫苗免疫背景下研究天然半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(NH-GD)的鑒別診斷能力。方法

布魯氏菌病;半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn);鑒別診斷

Supported by the Construction Program of Modern Agricultural (cows) Industrial Technology System(CARS-37)

Correspondence authors:FAN wei-xing,Email:fwx521@126.com

近年來，我國(guó)人畜間布魯氏菌病(以下簡(jiǎn)稱“布病”)病例呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅畜牧生產(chǎn)、食品安全和衛(wèi)生安全。布病作為一種人獸共患病，人的感染風(fēng)險(xiǎn)極高，僅在2015年一年全國(guó)報(bào)告的人間布病病例就接近60 000例。常規(guī)的血清學(xué)診斷方法以光滑型脂多糖(S-LPS)抗原為基礎(chǔ)，包括虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等，能夠檢測(cè)到S-LPS抗體，但動(dòng)物接種疫苗后同樣產(chǎn)生針對(duì)S-LPS的抗體，不能達(dá)到區(qū)分布魯氏菌感染抗體和疫苗免疫抗體的目的。在我國(guó)執(zhí)行布病防控 “檢測(cè)-撲殺” 政策背景下，急需一種能夠鑒別布魯氏菌感染抗體和疫苗免疫抗體的診斷技術(shù)，以促進(jìn)“檢測(cè)-撲殺”政策的貫徹執(zhí)行。因此，尋找區(qū)分布魯氏菌感染抗體和疫苗免疫抗體的鑒別診斷技術(shù)不僅僅是一項(xiàng)科研任務(wù)，對(duì)我國(guó)布病防控政策的實(shí)施亦具重要意義。

除了S-LPS分子外，光滑型布魯氏菌表面還有一種天然半抗原(Native Hapten，NH)。有研究表明，接種S19疫苗的動(dòng)物血清中檢測(cè)不到NH抗體的存在[1]，而野毒感染血清中能夠檢測(cè)到NH抗體的存在。所以，基于NH建立的檢測(cè)方法可以為鑒別診斷提供新的思路。之前有報(bào)道稱，在歐洲利用NH抗原的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Gel Diffusion, GD)可以很好地區(qū)別Rev.1疫苗免疫與野毒感染。西班牙布病專家BLASCO對(duì)布魯氏菌NH抗原進(jìn)行很多研究，肯定其在布病感染和疫苗免疫中的鑒別診斷作用[2]。在BLASCO的幫助下，研究NH-GD試驗(yàn)在S2、Rev.1免疫背景下對(duì)布病感染抗體和S2、Rev.1免疫抗體的鑒別診斷能力，為我國(guó)布病防控政策的執(zhí)行提供一種鑒別診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 血清與菌株 61份布病陽性血清 采自無布病疫苗接種史的綿羊群，且經(jīng)RBT、SAT和CFT檢測(cè)為陽性的血清；300份布病陰性血清：采自無布病發(fā)病史的綿羊群，經(jīng)RBT、SAT和CFT檢測(cè)為陰性的血清。S2、Rev.1疫苗免疫血清：S2口服免疫、Rev-1點(diǎn)眼免疫各接種20只健康綿羊，分別在免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d、58 d、90 d、122 d采集血清。B.mehitensis16M菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。布魯氏菌病陽性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(Z112)、布魯氏菌病陰性血清(Z3)：購自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。

1.2 試劑 瓊脂(DifcoTMAgar Noble)購自BD公司；硼酸、氯化鉀、氯化鈉購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)NH抗原由西班牙阿拉貢食品研究與技術(shù)中心(CITA)饋贈(zèng)；布魯氏菌熒光偏振測(cè)定法(FPA)試管型抗體檢測(cè)試劑盒購自哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 布魯氏菌擴(kuò)增與滅活B.mehitensis16M接種于BS斜面培養(yǎng)基，5%～10% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3-4 d，待布魯氏菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用PBS(pH7.2)洗滌菌苔，收集菌液，加入苯酚至終濃度0.5%，37℃培養(yǎng)24 h滅活，將滅活后的菌液接種BS平皿，觀察細(xì)菌滅活效果。

1.3. 2 抗原制備 根據(jù)之前已報(bào)道的方法[3]，我們對(duì)抗原進(jìn)行了制備，步驟簡(jiǎn)寫如下：將滅活后的菌液，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清；沉淀物加滅菌生理鹽水重懸，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，洗滌兩次；按體積比1∶4加雙蒸水重懸沉淀物，121 ℃高壓30 min；12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清，加入3倍體積無水乙醇，4℃攪拌過夜；15 000 r/min 4 ℃離心20 min，取沉淀物，用適量雙蒸水重懸，透析、凍干、稱重，所得產(chǎn)物為NH-LPS抗原混合物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.3.1 硼酸緩沖液的配制 稱取硼酸6.2 g、氯化鉀7.25 g，向其中加入800 mL ddH2O，攪拌至溶化，用濃度為1 mol/L的NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)值至8.3后將溶液定容至1 000 mL。

1.3.3.2 瓊脂平皿的制備 每100 mL硼酸緩沖液加入不同濃度瓊脂，10 g氯化鈉，水浴加熱至完全溶解，在直徑為90 mm的一次性塑料平皿中加入14 mL瓊脂溶液，待瓊脂凝固后備用。

1.3.3.3 抗原工作濃度與感作溫度的優(yōu)化 將制備好的抗原稀釋為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL 6個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度分別用6份羊布病陽性血清(強(qiáng)陽性、中等強(qiáng)度陽性、弱陽性血清各2份)進(jìn)行測(cè)定。用孔徑3 mm、孔距3 mm的梅花型打孔器進(jìn)行打孔，加熱封底，中央孔加入20 μL半抗原，周邊6個(gè)孔中各加入20 μL血清。將平皿放置于濕盒中，分別在22 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃ 4個(gè)條件下進(jìn)行孵育，連續(xù)觀察，記錄結(jié)果。選擇所有血清均出現(xiàn)清晰沉淀帶的最低半抗原濃度和感作溫度為最佳反應(yīng)條件。

1.3.3.4 瓊脂平皿濃度的優(yōu)化 依次制備0.6%、1.0%、1.2%、1.5%、1.7%、2% 6種濃度的瓊脂平皿，如1.3.3.3打孔、封底，孔中央孔加入最佳濃度半抗原，周邊孔加入羊布病陽性血清，放置濕盒中在最佳溫度下感作，連續(xù)觀察，記錄結(jié)果。以出現(xiàn)最清晰沉淀帶的瓊脂濃度為最佳瓊脂濃度。

1.3.4 敏感性與特異性試驗(yàn) 對(duì)61份羊布病陽性血清和300份羊布病陰性血清按優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行NH-GD試驗(yàn)，設(shè)NH-GD陰性、陽性血清為對(duì)照，連續(xù)觀察，記錄感作時(shí)間和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 羊免疫血清NH-GD試驗(yàn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的S2、Rev.1疫苗接種后第7 d、14 d、21 d、28 d、58 d、90 d、122 d的羊免疫血清(每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各20份)進(jìn)行NH-GD試驗(yàn)，設(shè)NH-GD陰性、陽性血清為對(duì)照，連續(xù)觀察，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 結(jié)果判讀 由于NH分子量小，在瓊脂凝膠中擴(kuò)散速度比S-LPS快，因此靠近血清一側(cè)的白色沉淀帶為NH沉淀帶，靠近半抗原一側(cè)的白色沉淀帶為S-LPS沉淀帶。出現(xiàn)NH、S-LPS兩條帶(如圖1)或出現(xiàn)NH一條帶為布病陽性動(dòng)物或免疫動(dòng)物；出現(xiàn)S-LPS一條帶，為免疫動(dòng)物。當(dāng)梅花孔中均為陽性血清時(shí)NH沉淀帶與S-LPS沉淀帶分別相互融合形成環(huán)狀，此時(shí)S-LPS沉淀帶在抗原孔周邊成環(huán)，不易拍攝出。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(周邊孔)與半抗原(中心孔)的沉淀反應(yīng)Fig.1 Precipitation reaction between standard positive sera (in border wells) and NH (in center well)

1.3.7 熒光偏振試驗(yàn)(FPA) 按布魯氏菌熒光偏振測(cè)定法(FPA)試管型抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，對(duì)61份羊布病陽性血清、300份羊布病陰性血清及S2、Rev.1疫苗免疫血清進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 抗原工作濃度、感作溫度的優(yōu)化試驗(yàn) 選取6份布病陽性羊血清，分別編號(hào)為1-6，其中1號(hào)、2號(hào)為強(qiáng)陽性血清，3號(hào)、4號(hào)為中等強(qiáng)度陽性血清，5號(hào)、6號(hào)為弱陽性血清。結(jié)果表明，陽性血清能夠在抗原濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL時(shí)均能與NH形成沉淀帶，并聯(lián)結(jié)成沉淀環(huán)(如圖2)。因此，選擇1.0 mg/mL為最佳抗原工作濃度。在22 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃ 4個(gè)感作溫度中，25 ℃條件下弱陽性血清(5、6號(hào))出現(xiàn)的NH沉淀帶最為完整、清晰見圖2B，因此選擇25 ℃為最佳感作溫度。

A: 22 ℃ B: 25 ℃ C: 30 ℃ D:37 ℃圖2 半抗原工作濃度、感作溫度的優(yōu)化試驗(yàn)Fig.2 Optimization of antigen concentration and temperature

2.2 瓊脂濃度優(yōu)化試驗(yàn) 瓊脂濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，1.2%瓊脂平皿中的NH沉淀帶最為清晰且5號(hào)、6號(hào)弱陽性血清均出現(xiàn)的沉淀帶最為清晰(如圖3)，因此最佳瓊脂平皿濃度為1.2%。

A:0.6% B:1.0% C:1.2% D:1.5% E:1.7% F:2.0%圖3 瓊脂濃度優(yōu)化試驗(yàn)Fig.3 Optimization of agar concentration

2.3 敏感性和特異性 用NH-GD試驗(yàn)對(duì)61份羊布病陽性血清和300份羊布病陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，至第4 d NH沉淀帶的數(shù)量不再增加，檢測(cè)結(jié)果見表1。

2.4 重復(fù)性 利用同一批次的抗原對(duì)羊布病陽性血清、羊布病陰性血清進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)，所得結(jié)果一致。

用2個(gè)批次的抗原對(duì)上述血清進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，所得結(jié)果一致。因此NH-GD試驗(yàn)有較好的重復(fù)性。

表1 NH-GD試驗(yàn)的敏感性與特異性
Tab.1 Sensitivity and specificity of NH-GD Assay

類別Category數(shù)量AmountNH-GD+positiveNH-GD-negative敏感性Sensitivity特異性specificity羊布病陽性血清(sheeppositiveserum)61461575.4%羊布病陰性血清(sheepnegativeserum)3000300100%

2.5 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果 NH-GD和FPA對(duì)61份羊布病陽性血清和300份羊布病陰性血清檢測(cè)結(jié)果比較分析發(fā)現(xiàn)：NH-GD雖敏感性低于FPA的敏感性，但兩種方法的特異性均達(dá)到100%，見表2，并且兩種方法比較Kappa≥0.75(P<0.01)，一致性較好，見表3。

表2 NH-GD與FPA的敏感性與特異性
Tab.2 Sensitivity and specificity of NH-GD and FPA

敏感性(%)Dsn特異性(%)DspFPA93.4100NH-GD75.4100

表3 NH-GD與FPA結(jié)果比較
Tab.3 Comparing results of NH-GD and FPA

NH-GDTotalKappavalue+-FPA+4611570.876-0304304Total46315361

2.5 NH-GD的鑒別診斷試驗(yàn) 利用NH-GD、RBT、SAT、FPA 4種方法，對(duì)接種疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)采集的羊血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明接種S2疫苗的羊血清中檢測(cè)不出NH抗體存在(如圖4A)，而接種Rev.1疫苗122 d后NH-GD試驗(yàn)陽性率為0(如圖4B)。除FPA在接種S2疫苗58 d后的羊血清中檢測(cè)不到S2免疫抗體外，這3種方法在不同的時(shí)間點(diǎn)都能檢測(cè)到疫苗免疫抗體。

A: S2口服免疫 B：Rev.1點(diǎn)眼免疫A: oral immunized by S2 B: conjunctival immunized by Rev.1圖4 鑒別診斷試驗(yàn)Fig.4 Differentiation test of natural infection and vaccination

3 討 論

通過優(yōu)化試驗(yàn)，我們確定NH-GD試驗(yàn)最佳反應(yīng)條件為：抗原濃度1 mg/mL、25 ℃感作、瓊脂平皿濃度1.2%、感作時(shí)間3 d。利用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，我們測(cè)定NH-GD試驗(yàn)的敏感性為75.4%，特異性為100%且具有較好的重復(fù)性。與FPA試驗(yàn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩種檢測(cè)方法一致性較好。分析不同時(shí)間點(diǎn)的S2、Rev.1免疫血清的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：口服S2免疫血清呈NH-GD檢測(cè)陰性，點(diǎn)眼接種Rev.1疫苗122 d以后NH-GD檢測(cè)陽性率為0；而RBT、SAT在相同的時(shí)間點(diǎn)都能檢測(cè)出較高的免疫抗體陽性率；FPA除在S2免疫58 d后的羊血清檢測(cè)不到免疫抗體外，也能檢測(cè)到免疫抗體。因此，NH-GD試驗(yàn)比RBT、SAT和FPA具有更強(qiáng)的鑒別診斷能力。

半抗原多糖(Native Hapten, NH)，分子量小，無內(nèi)毒素活性，位于布魯氏菌表面，與O鏈相互纏繞[4]。由于半抗原缺乏核心糖(N-formyperosamine)位點(diǎn)，且分子量小所以其免疫原性較低。有報(bào)道稱在S19疫苗免疫的動(dòng)物血清中檢測(cè)不到半抗原多糖抗體的存在，所以NH抗原應(yīng)該能夠鑒別野毒感染與疫苗免疫。由于NH抗原是布魯氏菌所特有的，因此利用NH半抗原構(gòu)建的檢測(cè)方法，在鑒別假陽性方面有不錯(cuò)的表現(xiàn)[5-6]。

NH-GD試驗(yàn)與常規(guī)布病的血清學(xué)檢測(cè)方法相比，具有以下的優(yōu)勢(shì)：首先操作技術(shù)和儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，結(jié)果可肉眼直觀，成本低；其次，NH-GD試驗(yàn)具有鑒別布病感染抗體與S2、Rev.1疫苗免疫抗體的診斷能力，可以從免疫動(dòng)物中篩選出布病感染動(dòng)物。當(dāng)然，NH-GD試驗(yàn)也有不足，主要表現(xiàn)在以下兩方面：一是NH-GD敏感性低(75.4%)，這與布魯氏菌產(chǎn)生的抗原刺激強(qiáng)弱有關(guān)[7]，因此沒有出現(xiàn)NH沉淀帶不一定是布病陰性動(dòng)物；二是布魯氏菌培養(yǎng)需要在符合生物安全三級(jí)(BSL-3)要求的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，多數(shù)地方不具備這個(gè)條件。

雖然NH-GD試驗(yàn)的敏感性不具有太大的優(yōu)勢(shì)，但其特異性非常高，且在S2和Rev.1免疫背景下，能夠鑒別布病感染抗體和疫苗免疫抗體。沒有一種實(shí)驗(yàn)方法能夠達(dá)到100%的敏感性和特異性，因此可用敏感性高的RBT進(jìn)行初篩實(shí)驗(yàn)，再用特異性高的NH-GD試驗(yàn)進(jìn)行確診。兩種實(shí)驗(yàn)方法的組合能夠更有效地從接種S2和Rev.1疫苗的羊群中鑒別出自然感染布魯氏菌的羊，便于布病防控措施的實(shí)施、及時(shí)切斷布病傳染源頭以控制或減少布病疫情的發(fā)生。綜上所述，NH-GD試驗(yàn)是一個(gè)不錯(cuò)的鑒別診斷方法，可以為布病防控政策“檢測(cè)-撲殺”的實(shí)施提供技術(shù)支持。

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Application of native hapten-gel diffusion test in differential diagnosis ofBrucella-infected antibody and S2 or Rev.1-vaccinated antibody

YANG Zhen，NI Bo，TIAN Li-li，F(xiàn)AN Wei-xing

(ChinaAnimalHealthAndEpidemiologyCenter,Qingdao266000,China)

The aim of the present study was to work on the efficiency of differential diagnosis of native hapten-gel diffusion assay (NH-GD) on the background of vaccination with S2 or Rev.1. The conditions of NH-GD assay was firstly optimized, its sensitivity, specificity, repeatability and ability of differential diagnosis were determined respectively, and its test result was compared with that of fluorescence polarization assay (FPA).The results showed NH-GD assay with good specificity and repeatability could differentiateBrucella-infected antibody from vaccinated antibody after vaccination with S2 or 122 days after vaccination with Rev.1.And the result of NH-GD assay was highly consistent with that of FPA ,which was simple to operate and needed a few simple equipment. Therefore, NH-GD assay was a good method for sheep brucellosis surveillance in China and especially suitable for application in grass-roots areas.

brucellosis;NH-GD;differential diagnosis

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.007

范偉興，Email: fwxsjl@126.com

中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266000

R378

A

1002-2694(2017)02-0126-05

2016-11-12 編輯：李友松

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(CARS-37)資助

優(yōu)化NH-GD試驗(yàn)條件，測(cè)定其敏感性、特異性、重復(fù)性及鑒別診斷能力，并與熒光偏振測(cè)定法(FPA)作比較。結(jié)果 NH-GD試驗(yàn)具有很好的特異性和重復(fù)性，對(duì)S2免疫羊群從疫苗接種開始就具有鑒別診斷能力，而對(duì)Rev.1免疫羊群從疫苗接種122 d開始具有鑒別診斷能力；與FPA作比較，一致性較好，且操作技術(shù)和所需儀器都非常簡(jiǎn)單，特別適合在基層推廣使用，為我國(guó)羊布病監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)很好的檢測(cè)方法。