李方達(dá)，李匯華，田 翠，聶 皓，鄭月宏

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 1007302大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病研究所，遼寧大連 1160113大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院慢性非傳染性疾病預(yù)防控制中心，遼寧大連 1160444首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069

·論 著·

硼替佐米對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成的影響

李方達(dá)1，李匯華2，3，田 翠4，聶 皓1，鄭月宏1

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 1007302大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病研究所，遼寧大連 1160113大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院慢性非傳染性疾病預(yù)防控制中心，遼寧大連 1160444首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069

目的研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米(BTZ)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠腹主動(dòng)脈瘤(AAA)形成的炎性機(jī)制的影響。方法8～10周齡雄性ApoE-/-小鼠40只，喂養(yǎng)1周適應(yīng)后隨機(jī)分為Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組4組，每組10只。Ang Ⅱ 組采用皮下埋植 AngⅡ 緩釋泵[1000 ng/(min·kg)]復(fù)制動(dòng)物AAA模型，BTZ組和Ang Ⅱ+BTZ組同時(shí)給予蛋白酶體抑制劑BTZ腹腔注射50 μg/kg每周2次。28 d后取材測(cè)量統(tǒng)計(jì)腹主動(dòng)脈最大直徑及AAA發(fā)生率。采用HE染色觀察組織中炎癥反應(yīng)情況，免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)組織中T淋巴細(xì)胞數(shù)目，qPCR檢測(cè)組織中黏附因子(ICAM- 1)的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)組織中核轉(zhuǎn)錄活化因子信號(hào)通路(NF-κB)表達(dá)變化。結(jié)果Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組小鼠的腹主動(dòng)脈最大直徑平均值分別為(1.00±0.01)、(0.99±0.01)、(1.50±0.13) 和(1.20±0.04) mm (F=8.959，P=0.000)，其中，Ang Ⅱ組明顯高于Sham組(P=0.000)和Ang Ⅱ+BTZ組(P=0.015)。Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+BTZ組和Sham組的AAA發(fā)生率分別為60%、17%和0。HE染色結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組血管壁厚度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目較Sham組和AngⅡ+BTZ組明顯增加。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)為107.9±15.9，明顯高于Sham組的0(P=0.000)和Ang Ⅱ+BTZ組的0.8±0.5(P=0.000)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，造模1周后，Ang Ⅱ組組織中CD3+T淋巴細(xì)胞比例為(13.50±0.69)%，明顯高于AngⅡ+BTZ組的(10.40±0.78)%(t=3.009，P=0.040)；造模4周后，AngⅡ組的CD3+T淋巴細(xì)胞比例為(22.70±0.93)%，明顯高于AngⅡ+BTZ組的(15.10±0.97)%(t=5.654，P=0.005)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組ICAM- 1的mRNA表達(dá)水平相比于Sham組升高比例分別為 1.00±0.15、0.34±0.03、1.93±0.54和0.83±0.08(F=6.797，P=0.001)，其中，Ang Ⅱ組明顯高于Sham組(P=0.011)和Ang Ⅱ+BTZ組(P=0.009)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組NF-κB核轉(zhuǎn)錄抑制因子磷酸化水平較Sham組和Ang Ⅱ+BTZ組明顯減少，并伴隨p65磷酸化水平增加。結(jié)論BTZ可能是通過(guò)抑制組織中NF-κB信號(hào)通路激活，下調(diào)ICAM- 1表達(dá)，并進(jìn)一步抑制CD3+T淋巴細(xì)胞聚集，減輕組織炎癥反應(yīng)，從而抑制AAA發(fā)生發(fā)展。

腹主動(dòng)脈瘤；蛋白酶體；硼替佐米；炎癥；核轉(zhuǎn)錄活化因子信號(hào)通路

ActaAcadMedSin，2017,39(1)：120-127

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是老齡化社會(huì)的常見(jiàn)病[1]，目前缺乏有效的藥物干預(yù)，以外科治療為主。AAA發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要包括炎癥反應(yīng)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)活化、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡及表型轉(zhuǎn)換、氧化應(yīng)激等，其中特異性炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)為關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2- 3]。核轉(zhuǎn)錄活化因子信號(hào)通路(nuclear factor κB signaling，NF-κB)為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路，在AAA形成中作用關(guān)鍵[4]。研究表明，腹主動(dòng)脈中內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC等細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路激活，可通過(guò)增加炎性因子、黏附因子表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附聚集，導(dǎo)致MMPs合成及分泌增多，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解等，推動(dòng)AAA形成[5]，提示抑制NF-κB信號(hào)通路活化可作為干預(yù)AAA發(fā)生發(fā)展的重要靶點(diǎn)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白降解處理系統(tǒng)，為細(xì)胞內(nèi)清除體內(nèi)異常合成及損壞蛋白的重要機(jī)制之一。蛋白酶體是UPS的主要功能復(fù)合體，負(fù)責(zé)降解多聚泛素化靶蛋白[6]。研究顯示，蛋白酶體活性改變可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[7]。其中，蛋白酶體降解NF-κB核轉(zhuǎn)錄抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)為NF-κB信號(hào)通路的經(jīng)典活化途徑[8]。以往研究表明，蛋白酶體在炎癥反應(yīng)、VMSC表型轉(zhuǎn)換等AAA相關(guān)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，提示蛋白酶體可參與AAA的發(fā)生。硼替佐米(bortezomib，BTZ)是廣譜蛋白酶體抑制劑，可有效抑制蛋白酶體活性，目前已用于多發(fā)性骨髓瘤的臨床診治。近期研究表明，低劑量BTZ可通過(guò)抑制組織的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩LDLR-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[9]。本課題組前期研究顯示，在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AAA模型中，采用低劑量BTZ部分抑制蛋白酶體活性，可抑制AAA的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體可通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換參與AAA形成。此外，低劑量BTZ還可有效抑制CD45+炎癥細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)及炎性因子的分泌，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確[10]。本研究觀察了BTZ對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AAA模型中炎癥反應(yīng)的影響。

材料和方法

材料雄性SPF級(jí)C57BL/6 ApoE-/-小鼠40只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：No.85- 23，1996，鼠齡8～10周，體重20～25 g。Ang Ⅱ(貨號(hào)：A9525，美國(guó)Sigma公司)，Trizol(美國(guó) Invitrogen公司)，免疫組織化學(xué)抗體抗CD3 (ab5690) (美國(guó)Abcam公司)，抗小鼠或抗兔抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，流式抗體APC-Cy7-labeled CD45、FITC-labeled CD3(美國(guó)BD Biosciences公司)。微量緩釋泵(貨號(hào)Model 2004，美國(guó)Durect Corporation公司)，熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM (日本Takara公司)，熒光定量PCR儀器 (美國(guó)Lite Technologies公司)，光學(xué)顯微鏡(日本 OLYPUMS公司)。引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

動(dòng)物分組及模型建立40只ApoE-/-小鼠在清潔環(huán)境中分籠飼養(yǎng)1周適應(yīng)后隨機(jī)分為Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組4組，每組10只：Ang Ⅱ組和AngⅡ+BTZ組小鼠背部肩胛間皮下手術(shù)植入已預(yù)裝Ang Ⅱ的緩釋泵，持續(xù)釋放Ang Ⅱ 1000 ng/(min·kg)；Sham組和BTZ組則于皮下置入輸注生理鹽水的緩釋泵；術(shù)后飼養(yǎng)4周。將BTZ溶于少量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中存于-20℃?zhèn)溆茫褂脮r(shí)混懸于100 μl生理鹽水中備注射用。BTZ組和Ang Ⅱ+BTZ組接受BTZ腹腔注射，劑量為50 μg/kg，每周2次。Sham組和Ang Ⅱ組則接受生理鹽水注射，每次100 μl，每周2次。

小鼠動(dòng)脈獲取、腹主動(dòng)脈直徑測(cè)定及AAA發(fā)生率計(jì)算小鼠接受藥物處理至預(yù)定日期后，經(jīng)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，解剖游離剪斷頸動(dòng)脈取血。大體解剖鏡下配合顯微器械在體分離腹主動(dòng)脈，游離腎動(dòng)脈到髂動(dòng)脈分叉之間的腹主動(dòng)脈，自主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈末端分叉離斷整個(gè)主動(dòng)脈及主動(dòng)脈的頸動(dòng)脈分支，離斷心臟。置于背景板，觀察主動(dòng)脈形態(tài)，游標(biāo)卡尺測(cè)量腎上腹主動(dòng)脈最大外徑，數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。固定相機(jī)與血管的相對(duì)距離，拍照參數(shù)保持一致，收集血管大體圖片，采用Image-Pro Plus 6.0獨(dú)立完成測(cè)量，求得最大直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將腹主動(dòng)脈最大寬度超過(guò)正常小鼠腎上動(dòng)脈寬度的50%定義為動(dòng)脈瘤。對(duì)于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡的小鼠，如果通過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)AAA破裂出血的小鼠也計(jì)算在AAA中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，動(dòng)脈或置于4%多聚甲醛灌注固定、脫水石蠟包埋，或置于凍存管液氮罐內(nèi)保存。

炎癥反應(yīng)指標(biāo)觀察

HE染色：石蠟切片置于二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)中浸泡10 min脫蠟；梯度乙醇浸泡 100%×5 min×2；95%×5 min×2；80%×5 min×1；流水2 min。后吸水紙吸干水分。蘇木素染色4～8 min，自來(lái)水沖洗；1%鹽酸水溶液分化5～10 s；自來(lái)水洗返藍(lán)15～30 min；0.5%伊紅染色0.5～1 min；梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min×2。中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)。每張切片選取 5個(gè)具有代表性的高倍視野(10×10倍)。

免疫組織化學(xué)染色：采用EnVision或EliVision法，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，具體為：脫蠟及水化同HE染色；檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)，蒸餾水洗3次，吸水紙擦干周圍水分；0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液室溫孵30 min，0.01 mol/L PBS洗消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響；0.3%Triton×100室溫孵30 min，0.01 mol/L PBS洗，增加細(xì)胞的通透性；動(dòng)物血清室溫孵育20 min；滴加稀釋一抗，過(guò)夜，4℃；棄一抗，0.01 mol/L PBS洗；滴加二抗，室溫孵，30 min；0.01 mol/L PBS洗；在顯微鏡下進(jìn)行觀察把握DAB顯色時(shí)間(約8 min)；水洗；蘇木精復(fù)染10 min，鹽酸酒精分化1～2 s；自來(lái)水洗10～15 min；梯度酒精脫水及二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明同HE染色。中性樹(shù)脂封片，顯微鏡檢并統(tǒng)計(jì)分析。每張切片選取 5個(gè)具有代表性的高倍視野(10×40倍)。

流式細(xì)胞技術(shù)：參照文獻(xiàn)[11]的方法制備小鼠血液、主動(dòng)脈單細(xì)胞懸液。取流式細(xì)胞上樣專用管(FACS tube)，根據(jù)需要設(shè)定單標(biāo)及空白對(duì)照，轉(zhuǎn)移一部分單細(xì)胞懸液于FACS tube。過(guò)飽和加入抗體溶液，震蕩混勻，室溫孵育30 min。離心收集結(jié)合抗體的細(xì)胞。最終以500 μl 2% 多聚甲醛重懸。根據(jù)ACS Aria 流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)上樣，調(diào)整電壓、補(bǔ)償、門控等參數(shù)，獲取相關(guān)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果用Flow Jo軟件分析。

實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光法檢測(cè)基因表達(dá)采用TRIZOL法提取動(dòng)脈總RNA[12]。參照ImProm-ⅡTMReverse Transcription System說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-SYBR Green熒光定量PCR。引物序列：(1)細(xì)胞間黏附分子- 1(intercellular cell adhesion molecule- 1，ICAM- 1)：(F)5’-CCTTCCTCACCGTGTACTGG- 3’，(R)5’-AGCGTAGGGTAAGGTTCTTGC- 3’；(2) 甘油醛- 3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)：(F)5’-TGTACCGTCTAGCATATC- TCCGAC- 3’，(R)5’-ATGATGTGCTCTAGCTCTGGGTG- 3’。

Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)取出-80℃冰凍組織，眼科剪初步剪碎，超聲勻漿充分裂解組織后低溫離心機(jī)離心，留取上清即為蛋白溶液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE 電泳，Gel-pro 4.5軟件分析蛋白條帶。所用抗體兔抗GAPDH (sc- 2118)、p-p65(sc- 3033)、t-p65(sc- 4764)、p-IκBα(sc- 2859)、t-IκBα(sc- 4812)均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ApoE-/-小鼠AAA發(fā)生率Ang Ⅱ灌注可明顯增大小鼠腹主動(dòng)脈的直徑，給予BTZ則可明顯降低小鼠腹主動(dòng)脈的直徑(圖1)。Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組小鼠的腹主動(dòng)脈最大直徑平均值分別為(1.00±0.01)、(0.99±0.01)、(1.50±0.13) 和(1.20±0.04) mm (F=8.959，P=0.000)，其中，Ang Ⅱ組明顯高于Sham組(P=0.000)和Ang Ⅱ+BTZ組(P=0.015)。Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組小鼠的AAA發(fā)生率分別為0、0、60%和17%。

ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)HE染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，Ang Ⅱ組ApoE-/-小鼠AAA組織中的血管壁厚度增加，伴隨中膜層及外膜層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而在AngⅡ+BTZ組中，血管壁炎癥反應(yīng)明顯減輕(圖2)。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)為107.9±15.9，明顯高于Sham組的0(P=0.000)和Ang Ⅱ+BTZ組的0.8±0.5(P=0.000)(圖3)。

圖1 各組典型的主動(dòng)脈大體照片

Fig 1 Photos of representative aortas of all groups

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，造模1周后，Ang Ⅱ組組織中CD3+T淋巴細(xì)胞比例為(13.50±0.69)%，明顯高于AngⅡ+BTZ組的(10.40±0.78)% (t=3.009，P=0.040)；造模4周后，AngⅡ組的CD3+T淋巴細(xì)胞比例為(22.70±0.93)%，明顯高于AngⅡ+BTZ組的(15.10±0.97)%(t=5.654，P=0.005)(圖4)。

ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈組織中ICAM- 1的表達(dá)情況qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Sham組、BTZ組、Ang Ⅱ組和Ang Ⅱ+BTZ組ICAM- 1的mRNA表達(dá)水平相比于Sham組升高比例分別為1.00±0.15、0.34±0.03、1.93±0.54和0.83±0.08 (F=6.797，P=0.001)，其中，Ang Ⅱ組明顯高于Sham組(P=0.011)和Ang Ⅱ+BTZ組(P=0.009)。

ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ang Ⅱ組IκB磷酸化水平較Sham組和Ang Ⅱ+BTZ組明顯減少，并伴隨p65磷酸化水平增加(圖5)。

討 論

已知特異性炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)為AAA發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在AAA發(fā)病過(guò)程中，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等高危因素均可誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈壁NF-κB信號(hào)通路的激活，并通過(guò)促進(jìn)黏附因子等炎性介質(zhì)的表達(dá)介導(dǎo)AAA形成[13- 14]。蛋白酶體降解泛素化標(biāo)記的p-IκB激活NF-κB信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)一步可促進(jìn)炎性因子、黏附因子等靶蛋白合成，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15]，提示蛋白酶體可能參與AAA形成。本研究采用Ang Ⅱ誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠AAA模型進(jìn)行研究，通過(guò)廣譜蛋白酶體抑制劑BTZ抑制組織中蛋白酶體活性，結(jié)果顯示BTZ可有效降低ApoE-/-小鼠AAA的發(fā)生率，提示蛋白酶體激活在可能在ApoE-/-小鼠AAA形成過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

圖2 造模28 d后，ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈HE染色

Fig 2 HE staining of abdominal aorta from ApoE-/-mice 28 days after modeling

圖3 造模28 d后典型的小鼠腹主動(dòng)脈CD3+T淋巴細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色

Fig 3 Immunohistochemical staining of CD3+T cells in abdominal aorta from ApoE-/-mice 28 days after modeling

aP<0.05，bP<0.01

A.各組典型的流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖，方框內(nèi)為CD3+CD45+T淋巴細(xì)胞，百分?jǐn)?shù)為CD3+CD45+T淋巴細(xì)胞的平均含量；B.流式細(xì)胞分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析直方圖

A. results of flow cytometry in each group， inside the boxes were dot plots representing the CD3+CD45+T lymphocytes, the numbers tagged on the upper-right quadrant represent the average percentage of CD3+CD45+T lymphocytes in each group；B. histogram of statistical analysis of the flow cytometry

圖4 CD3+CD45+T淋巴細(xì)胞流式分析結(jié)果

Fig 4 Results of flow cytometry of CD3+CD45+T lymphocytes

IκB：NF-κB核轉(zhuǎn)錄抑制因子

IκB：inhibitor of NF-κB

圖5 Western blot檢測(cè)腹主動(dòng)脈組織中p-IκB、t-IκB、p-p65和t-p65蛋白表達(dá)情況

Fig 5 Western blot analysis of the protein levels of p-IκB，t-IκB，p-p65，and t-p65 in abdominal aorta

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體激活可通過(guò)調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)換促進(jìn)AAA形成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低劑量BTZ可有效抑制CD45+炎癥細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)，但具體調(diào)節(jié)方式尚不明確[10]。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)組織中炎癥反應(yīng)情況，明確在AAA形成過(guò)程中蛋白酶體對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。我們首先采用HE染色研究動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)變化，發(fā)現(xiàn)BTZ可有效減少動(dòng)脈壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈壁的炎性重塑，提示蛋白酶體激活可能是通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加速血管的炎性重塑，從而導(dǎo)致AAA形成。有研究表明，T 淋巴細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)血管壁細(xì)胞凋亡、分泌MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)等機(jī)制，促進(jìn)AAA發(fā)生發(fā)展[16- 17]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路激活可通過(guò)促進(jìn)輔助型T淋巴細(xì)胞(Th)向2型輔助型T淋巴細(xì)胞(Th2)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)AAA形成[12]。因此，本研究進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析技術(shù)分別檢測(cè)血管壁中CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AAA組織內(nèi)有大量的CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16- 17]。采用BTZ抑制蛋白酶體活性則可有效減少CD3+T淋巴細(xì)胞在動(dòng)脈壁的浸潤(rùn)，提示蛋白酶體激活可能是通過(guò)促進(jìn)CD3+T淋巴細(xì)胞在組織的浸潤(rùn)加重組織炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)AAA形成。

血管壁炎癥反應(yīng)與炎癥細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)密切相關(guān)。一般炎癥細(xì)胞游離在血液中，在疾病的特殊狀態(tài)下，血管壁表達(dá)特定黏附分子，招募特定的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集，導(dǎo)致血管疾病的發(fā)生。血管壁細(xì)胞表達(dá)ICAM- 1，對(duì)于招募循環(huán)中的T淋巴細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)具有更為重要的意義[18]。研究表明，ICAM- 1在AAA中表達(dá)升高，通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的黏附聚集，促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AAA形成[19]。ICAM- 1在AAA的外膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較正常組織明顯增多[19]，而淋巴細(xì)胞主要通過(guò)主動(dòng)脈壁的新生血管在外膜聚集[20- 22]。而在AAA中，ICAM- 1主要在外膜內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)升高，提示ICAM- 1與血管新生介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞聚集密切相關(guān)。以往研究表明，低劑量BTZ可延緩LDLR-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中主要機(jī)制為抑制組織中ICAM- 1等蛋白的表達(dá)，減輕組織炎癥反應(yīng)[9]。因此，本研究采用qPCR檢測(cè)動(dòng)脈壁中ICAM- 1的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)AAA中ICAM- 1的mRNA表達(dá)上調(diào)，而低劑量BTZ可有效抑制AAA中ICAM- 1的表達(dá)，提示蛋白酶體激活可能是通過(guò)上調(diào)組織中ICAM- 1表達(dá)促進(jìn)CD3+T淋巴細(xì)胞在組織的浸潤(rùn)。

研究發(fā)現(xiàn)，特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，可以減少ICAM- 1合成，減輕炎癥反應(yīng)，延緩AAA發(fā)生[23]，提示通過(guò)抑制NF-κB激活來(lái)減少ICAM- 1合成對(duì)于抑制AAA發(fā)生發(fā)展具有重要意義。因此，本研究采用Western blot法檢測(cè)了腹主動(dòng)脈組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在ApoE-/-小鼠AAA組織中，p-p65表達(dá)上調(diào)，而使用低劑量BTZ可抑制p-p65表達(dá)，提示BTZ可有效抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。蛋白酶體降解多聚泛素化標(biāo)記的抑制因子IκB為NF-κB信號(hào)通路的經(jīng)典活化方式。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了IκB在腹主動(dòng)脈組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在AAA組織中p-IκB表達(dá)明顯下調(diào)，使用BTZ抑制蛋白酶體活性后，p-IκB表達(dá)增加，進(jìn)一步提示在AAA形成中，蛋白酶體激活可通過(guò)降解p-IκB，激活NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，BTZ可能是通過(guò)抑制組織中NF-κB信號(hào)通路激活，下調(diào)ICAM- 1表達(dá)，并進(jìn)一步抑制CD3+T淋巴細(xì)胞聚集，減輕組織炎癥反應(yīng)，從而抑制AAA發(fā)生發(fā)展。本研究的不足之處在于，僅在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面探討蛋白酶體激活對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，缺乏體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)于AAA形成過(guò)程中，蛋白酶體對(duì)巨噬細(xì)胞等其他炎癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制尚未明確，這也是我們今后的研究方向。

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Effect of Bortezomib on Angiotensin Ⅱ-induced Abdominal Aortic Aneurysm in ApoE-/-Mice

LI Fangda1，LI Huihua2，3，TIAN Cui4，NIE Hao1，ZHENG Yuehong1

1Department of Vascular Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China2Department of Cardiology，Institute of Cardiovascular Diseases，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116011，China3Center for Prevention and Control of Non-communicable Chronic Diseases，School of Public Health，Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116044，China4Department of Physiology and Physiopathology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China

ZHENG Yuehong Tel：010- 69152501，E-mail：yuehongzheng@yahoo.com

Objective To investigate the role of proteasome inhibitor bortezomib (BTZ) in inflammatory response in abdominal aortic aneurysm (AAA) formation induced by angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ). Methods Ang Ⅱ-induced ApoE-/-mice AAA models were established. Forty male ApoE-/-mice (8- 10-week-old) were randomly and equally divided into four groups：Sham group，BTZ group，Ang Ⅱ group，and Ang Ⅱ+BTZ group.HE staining，immunohistochemical staining，and flow cytometry were used to analyze the inflammatory response. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was used to analyze the mRNA expression of intercellular cell adhesion molecule- 1 (ICAM- 1). Western blotting was used to analyze the activation of nuclear factor κB signaling (NF-κB). Results The mean maximum suprarenal aortic diameter (Dmax) of Sham group，BTZ group，Ang Ⅱ group，and Ang Ⅱ+BTZ group were (1.00±0.01)，(0.99±0.01)，(1.50±0.13)，and (1.20±0.04)mm，respectively (F=8.959，P=0.000). The Dmax of Ang Ⅱ group was significantly larger than those of Sham group (P=0.000) and Ang Ⅱ+BTZ group (P=0.015). The incidence of AAA in Ang Ⅱ group，Ang Ⅱ+BTZ group，and Sham group were 60%，17%，and 0，respectively. HE staining revealed that the abdominal aortic wall thickening was more severe in Ang Ⅱ group than in Sham group and Ang Ⅱ+BTZ group，similar with the infiltration of inflammatory cells. Immunohistochemical staining demonstrated that the CD3+T lymphocyte count was significantly higher in Ang Ⅱ group than in Sham group (107.9±15.9vs. 0，P=0.000) and Ang Ⅱ+BTZ group (107.9±15.9vs. 0.8±0.5，P=0.000). Flow cytometry also demonstrated that the proportion of the CD3+T lymphocytes of the Ang Ⅱ group [(13.50±0.69)%] was significantly higher than that in the Ang Ⅱ+BTZ group [(10.40±0.78)%] at week 1 (t=3.009，P=0.040)，and the proportion of the CD3+T lymphocytes of the Ang Ⅱ group [(22.70±0.93)%] was significantly higher than that in the Ang Ⅱ+BTZ group [(15.10±0.97)%] at week 4 (t=5.654，P=0.005). The qPCR analysis showed that the mRNA expression of ICAM- 1 was significantly up-regulated in Ang Ⅱ group than in Sham group (1.93±0.54vs. 1.00±0.15，P=0.011) and Ang Ⅱ+BTZ group (1.93±0.54vs. 0.83±0.08，P=0.009). Western blot analysis showed a lower phosphorylation level of inhibitor of NF-κB in the Ang Ⅱ group compared with the Sham group or Ang Ⅱ+BTZ group，accompanied with an increased phosphorylation level of p65. Conclusion Proteasome inhibitor BTZ can attenuate AAA formation partially by regulating T lymphocytes infiltration through regulating the mRNA expression of ICAM- 1 regulated by the activation of NF-κB signaling pathway.

abdominal aortic aneurysm；proteasome；bortezomib；inflammation；nuclear factor κB signaling

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270390、81470586)、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB517802)和長(zhǎng)江學(xué)者計(jì)劃Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81270390，81470586)，the National Basic Research Program of China (973 Program)(2012CB517802)，and the Chang Jiang Scholar Program

鄭月宏 電話：010- 69152501，電子郵件：yuehongzheng@yahoo.com

R363.2+1

A

1000- 503X(2017)01- 0120- 08

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.01.020

2016- 01- 07)