鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫(yī)院，山東青島266042)

血清miRNA檢測對直腸癌患者新輔助放化療效果的預測價值

鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫(yī)院，山東青島266042)

目的 探討血清微小RNA(miRNA)has-let-7a、-7e及-7g檢測對直腸癌患者新輔助放化療效果的預測價值。方法 選擇中低位直腸癌患者43例，均采用奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療5周。治療后根據(jù)Mandard腫瘤消退分級標準分為消退良好組18例，無明顯消退組25例。治療前采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)檢測血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達；用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g對直腸癌放化療后腫瘤病理消退程度的預測價值，對比三者ROC曲線下面積(AUC)。結(jié)果 治療前消退良好組血清miRNA has-let-7e相對表達量低于無明顯消退組(P<0.05)；兩組血清hsa-let-7a和has-let-7e表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。miRNA has-let-7e預測新輔助放化療效果的AUC大于has-let-7a、has-let-7g的AUC(P均<0.05)。結(jié)論 血清miRNA has-let-7e可作為預測直腸癌新輔助放化療療效的血清標志物。

直腸腫瘤；微小RNA；新輔助化療；放射治療

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)導致腫瘤相關(guān)死亡的重要原因之一，其中約30%為直腸癌[1]。多數(shù)直腸癌患者就診時已處于中晚期。近年來，新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療已經(jīng)成為中晚期直腸癌患者的標準治療手段。但由于患者個體差異較大，新輔助放化療療效也存在差異[2]。通過對放化療療效進行預測，對療效較差患者盡早給予手術(shù)治療，可避免無效治療[3]。目前臨床、代謝指標及影像學手段對療效的預測并不理想[4～6]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，能夠通過剪切或翻譯抑制對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后水平的負調(diào)控[7,8]。目前探討miRNAs是否可作為直腸癌新輔助化療療效預測標志物的研究較少[9～11]。本研究對miRNA has-let-7a、-7e及-7g在直腸癌新輔助化療療效預測中的價值進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2013年3月本院收治的中低位直腸癌患者43例，均經(jīng)腸鏡活檢確診，經(jīng)盆腔CT或MRI檢查確定腫瘤分期，經(jīng)輔助檢查排除肝或肺等遠端器官轉(zhuǎn)移，可耐受放化療。其中男32例、女11例，年齡32～78歲，TNM分期Ⅱ期4例、Ⅲ期39例，Karnofsky評分>60分?；颊呔炇鹬橥鈺?，并接受隨訪。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會批準。

1.2 治療方法 患者均接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療。放療方法：直線加速器X線照射靶區(qū)(直腸原發(fā)灶和淋巴引流區(qū)域)，用等中心三野照射法，后野∶左側(cè)野∶右側(cè)野=2∶1∶1，放射總劑量為50 Gy，2.0 Gy/次，1次/d，每周照射5 d?；煼椒ǎ簥W沙利鉑每次50 mg/m2，加入50 g/L葡萄糖注射液250 mL靜滴2 h，1次/周；卡培他濱每次800 mg/m2口服，2次/d，每周5 d。放化療同步進行，均連續(xù)治療5周。在新輔助放化療期間定期檢查患者血常規(guī)和肝腎功能，同時對患者進行積極對癥支持治療和營養(yǎng)治療。

1.3 療效評價標準 治療結(jié)束后用腫瘤病理消退程度來評價新輔助放化療治療效果。術(shù)后標本送病理科進行病理分析，采用Mandard腫瘤消退分級標準(TRG)對直腸癌病理消退情況進行評價，TRG1級：腫瘤完全消退，完全無殘留癌細胞；TRG2級：腫瘤消退良好，少量殘留癌細胞；TRG3級：腫瘤中度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，纖維化占26%～50%；TRG4級：腫瘤輕度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，但不超過腫瘤的25%；TRG5級：腫瘤無消退，腫瘤細胞無變化，無纖維組織。TRG1、2級視為腫瘤病理消退良好，TRG3、4、5級視為腫瘤無明顯消退[12]。

1.4 血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達檢測 采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(qRT-PCR)。治療前采集患者清晨空腹靜脈血，置于含枸櫞酸鈉的抗凝管中，經(jīng)低溫、超速和離心獲得血清，存放于-80 ℃冰箱備用。用miRNA提取試劑盒提取RNA，并檢測RNA質(zhì)量(A260/A280 為1.8～2.1)。通過Taqman miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書，以cDNA為反應(yīng)模板，依次加入上下游引物、2×SYBR green PCR Master Mix以及無RNase雙蒸水，配置成反應(yīng)體系。在ABI公司7300 PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)條件：預變性95 ℃ 10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共擴增40個循環(huán)，每個樣本重復2次。采用2-ΔΔct法計算miRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 不同消退程度患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g表達比較 43例患者經(jīng)治療后TRG1級9例、2級9例、3級17例、4級6例、5級2例；消退良好組18例，無明顯消退組25例。患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對表達量比較見表1。

表1 兩組治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對表達量比較

注：與無明顯消退組比較，*P<0.05。

2.2 miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g對放化療療效的預測價值 繪制ROC曲線，見圖1。miRNA has-let-7e的AUC(0.760)大于miRNA has-let-7a(0.551)、miRNA has-let-7g(0.560)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，miRNA has-let-7a與miRNA has-let-7g的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

圖1 miRNA has-let-7a、-7e及-7g預測直腸癌

3 討論

新輔助治療可以視為腫瘤患者腫瘤細胞的減量治療，包括術(shù)前化療或者術(shù)前化療與放療相結(jié)合，其能夠減小患者的腫瘤負荷，提高腫瘤患者手術(shù)完全切除率。XELOX已經(jīng)成為直腸癌化療一線治療方案的首選，是進展期直腸癌患者一種新的輔助治療手段。與術(shù)后放化療比較發(fā)現(xiàn)，新輔助放化療可以減少放化療毒副反應(yīng)、改進直腸癌局部控制、增加保肛率并且延長患者的無進展生存時間。但由于患者個體差異較大，新輔助放化療的治療效果差異也比較大。個體的遺傳因素是導致個體治療敏感性的重要因素[13]。研究表明，導致腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)為腫瘤信號通路異常。通過檢測分析患者腫瘤信號通路基因的表達水平，可以獲得腫瘤放化療耐受或敏感的分子標志物，利用這些分子標志物可以預測新輔助放化療的治療敏感性，加強患者的個體化治療[14]。同時研究也表明，腫瘤患者血漿中游離的DNA、RNA及某些基因突變與腫瘤組織保持著高度的一致性，因此外周血腫瘤標志物的篩選是目前腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一?；谀[瘤分子標志物可以優(yōu)化患者的個體治療，也是目前腫瘤治療的趨勢[15]。miRNA是高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA非常穩(wěn)定，在劇烈條件下，如高溫、驟冷、強酸、強堿等，都很難發(fā)生降解，同時期可以抵御由于RNA酶導致的降解。因此miRNA作為新的分子標志物將為腫瘤患者的早期診療提供全新的手段。

目前僅有少量研究探討循環(huán)miRNA在預測結(jié)直腸癌新輔助放化療療效的預測作用。miRNA has-let-7a、-7e、-7g可能為預測直腸癌新輔助放化療效果的因子[16,17]，但研究樣本量有限。在本研究中，我們納入43例直腸癌患者，檢測新輔助放化療前血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA has-let-7e表達水平與療效相關(guān)，miRNA has-let-7e高表達的直腸癌患者，新輔助放化療效果差；ROC曲線也顯示其對療效預測的準確度較高。未來需要更多前瞻性研究就miRNA has-let-7e對直腸癌新輔助放化療的預測作用進行驗證。

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袁海成(E-mail:yuanhaicheng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.030

R735.37

B

1002-266X(2017)05-0089-03

2016-11-14)