晏震，陳彥平，劉現(xiàn)云

(1河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院；3邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

多被銀蓮花總皂甙對(duì)ACC-M細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響

晏震1，陳彥平2，劉現(xiàn)云3

(1河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院；3邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

目的 探討多被銀蓮花總皂甙對(duì)人涎腺腺樣囊性癌高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(ACC-M)內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。方法 將體外培養(yǎng)的ACC-M細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，分別加入50 μg/mL多被銀蓮花總皂甙溶液2 mL、含同樣濃度二甲基亞砜的 RPMI1640培養(yǎng)液2 mL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；兩組間各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 多被銀蓮花總皂甙可上調(diào)ACC-M細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2升高。

涎腺腺樣囊性癌；高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞；多被銀蓮花總皂甙；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白

涎腺腺樣囊性癌(SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，該腫瘤易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且術(shù)后具有較高的局部復(fù)發(fā)率。目前尋找不良反應(yīng)小、可長(zhǎng)期應(yīng)用的抗腫瘤藥物一直是口腔醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。多被銀蓮花是毛茛科銀蓮花屬植物的根莖，藥理活性研究發(fā)現(xiàn)多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗驚厥及抑菌作用。目前研究表明,Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[1]。其中Bcl-2蛋白具有拮抗細(xì)胞凋亡作用稱為癌基因，而Bax蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用稱為抑癌基因。兩種蛋白正常情況下處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)細(xì)胞受到相關(guān)信號(hào)刺激時(shí)，兩種蛋白的平衡被打破，則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生。多被銀蓮花總皂甙對(duì)SACC高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(ACC-M)中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)有何影響，尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)告。本研究于2014年3月～2015年3月對(duì)其進(jìn)行探討，為多被銀蓮花總皂甙治療SACC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ACC-M細(xì)胞，由北京口腔醫(yī)院提供。多被銀蓮花總皂甙，取多被銀蓮花(石家莊樂仁堂藥店)1 kg，粉碎后用95%乙醇室溫浸泡3次，每次用乙醇5 L，回收乙醇，得到浸膏426.4 g；將浸膏放入800 mL水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次500 mL；將下層水溶液放進(jìn)圓底燒瓶，加入25 g固體KOH，80 ℃加熱水解2 h；用5%鹽酸調(diào)pH值至6。再用正丁醇萃取4次，每次500 mL，合并萃取液，減壓回收正丁醇，得總皂甙148.8 g，回收率為14.88%；用二甲基亞砜將多被銀蓮花總皂甙溶解配制成20 mg/mL的儲(chǔ)存液，于4 ℃恒溫冰箱儲(chǔ)存。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將儲(chǔ)存液稀釋為1、25、50、75、100 μg/mL濃度的使用液。

1.2 ACC-M細(xì)胞培養(yǎng)及藥物濃度確定 將ACC-M細(xì)胞取出培養(yǎng)于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞爬滿瓶底壁的80%時(shí)即可進(jìn)行傳代。用吸管將細(xì)胞吹打制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，細(xì)胞以1.0×105/mL接種于新的培養(yǎng)瓶中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)消化液消化后制成4.0×106/mL的細(xì)胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶2 mL，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。采用MTT比色試驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ACC-M細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為1、25、50、75、100 μg/mL的多被銀蓮花總皂甙100 μL，并設(shè)置對(duì)照和調(diào)零孔，每組5個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的預(yù)制MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清液，再加入二甲基亞砜溶液200 μL避光振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀測(cè)492 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度值。依據(jù)吸光度值計(jì)算各組的生長(zhǎng)抑制率并通過作圖法求出24、48、72 h的IC50值分別為 46.3、56.59、44.60 μg/mL，其最高抑制率可達(dá)90.3%，據(jù)此設(shè)定本實(shí)驗(yàn)銀蓮花總皂甙濃度為50 μg/mL。

1.3 ACC-M細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將貼壁后的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄培養(yǎng)液。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入50 μg/mL的多被銀蓮花總皂甙溶液2 mL，對(duì)照組加入含同樣濃度二甲基亞砜的 RPMI1640培養(yǎng)液2 mL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后提取各組細(xì)胞組織蛋白。參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用Odyssey成像系統(tǒng)掃描各條帶灰度值，并進(jìn)行半定量測(cè)定，將β-actin條帶作為內(nèi)參照。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。計(jì)算Bax蛋白與Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值(Bax/Bcl-2)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

干預(yù)24、48、72 h，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；兩組間各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同干預(yù)時(shí)間Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bax/Bcl-2比較

3 討論

SACC發(fā)病率約占涎腺癌的20%左右，可發(fā)生于任何年齡，以腭腺最為常見，大涎腺發(fā)病低但好發(fā)于頜下腺、舌下腺，無包膜，具有沿神經(jīng)血管侵襲及肺轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)。俞光巖等[2]分析顯示，SACC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率僅2.1%、而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)28.8%。目前治療方式主要為手術(shù)切除，輔以化療、放療、生物治療及中醫(yī)中藥治療等。由于其易侵襲，與周圍組織界限不清，手術(shù)中完整切除難度大，短期治療效果較好，遠(yuǎn)期容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其遠(yuǎn)期生存率為37.4%～41.8%[3]。致死的主要原因多為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中肺部轉(zhuǎn)移占比最高。目前的化療藥物不良反應(yīng)較大且臨床療效不甚理想。本研究的目的是為臨床尋找有效、不良反應(yīng)小、可長(zhǎng)期應(yīng)用的抗腫瘤藥物。

研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生與癌基因的高表達(dá)及抑癌基因的低表達(dá)密切相關(guān)[4,5]。Bcl-2家族蛋白可以通過改變線粒體膜的通透性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其機(jī)制為Bcl-2相關(guān)蛋白形成離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，引起線粒體膜的通透性改變，達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的。而Bcl-2家族兩種蛋白的構(gòu)成比例是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，其中Bax/Bcl-2是啟動(dòng)凋亡過程的關(guān)鍵。Korsmeye等[6]提出Bcl-2/Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的可變電阻器，在各種因素刺激下，細(xì)胞的生死直接取決于Bcl-2和Bax兩種因子平衡的結(jié)果。王晶等[7]發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物可使Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，從而降低線粒體膜電位抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖。目前研究認(rèn)為，當(dāng)Bcl-2和Bax通過形成二聚體來調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，二者形成異源二聚體時(shí)則能夠抑制細(xì)胞凋亡。Mackey等[8]分析了前列腺癌腫瘤組織中Bcl-2、Bax表達(dá)水平及Bcl-2/Bax與放療療效的關(guān)系，結(jié)果顯示Bcl-2/Bax升高是導(dǎo)致前列腺癌放療失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)預(yù)后因素。李永生等[9]研究發(fā)現(xiàn)，粉防己堿抑制人膀胱癌BIU-87的生長(zhǎng)與下調(diào)Bcl-2、Survivin和上調(diào)Bax、Capseae-3表達(dá)有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的，這兩種基因與腫瘤藥物治療的關(guān)系已成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一[10]。

中藥多被銀蓮花為毛莨科銀蓮花屬植物，其干燥根莖又稱為兩頭尖，藥性辛、熱、有毒，歸脾經(jīng)，具有消癰腫、祛風(fēng)濕的功效，臨床上常用來治療四肢拘攣、癰腫潰爛、風(fēng)寒濕痹、骨節(jié)疼痛等。研究發(fā)現(xiàn)，多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗驚厥、抑菌及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)等作用[11～13]。張爾賢等[14]從中藥多被銀蓮花中提取總皂苷(其中多被銀蓮花素A占20%)，測(cè)試總皂甙對(duì)小鼠肝癌H22、肉瘤S180和艾氏腹水癌EAC的抑瘤率以及體外對(duì)4種人癌細(xì)胞的抑制率，結(jié)果表明多被銀蓮花總皂甙具有明顯的抑瘤作用。前期實(shí)驗(yàn)中ACC-M細(xì)胞經(jīng)濃度為0、25、50、75 μg/mL多被銀蓮花總皂甙溶液干預(yù)72 h后，其凋亡率分別為21.11%、27.18%、30.6%、34.0%,表明多被銀蓮花總皂甙具有明顯抑制ACC-M細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，在50 μg/mL多被銀蓮花總皂甙藥物作用下,ACC-M細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低；且時(shí)間越長(zhǎng)，以上變化越明顯，Bax/Bcl-2逐漸增大。由此看來，多被銀蓮花總皂甙可下調(diào)ACC-M細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)以及上調(diào)Bax基因表達(dá)，使得Bax/Bcl-2增大，從而誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)急性髓系白血病患者的Bax、Bcl-2表達(dá)水平與患者疾病緩解率、無病生存率關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2對(duì)精確預(yù)測(cè)臨床療效有重要意義[15]。劉紅等[16,17]分別在卵巢癌、宮頸癌的臨床研究中得到類似結(jié)論。因此我們認(rèn)為，多被銀蓮花總皂甙能夠使ACC-M細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2增大從而抑制ACC-M細(xì)胞活性并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，多被銀蓮花總皂甙可以誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)及下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2增加，導(dǎo)致線粒體外膜的通透性改變，進(jìn)而引起ACC-M細(xì)胞凋亡。

[1] Kuwana T, Newmeyer DD. Bcl-2-family proteins and the role of mitochondria in apoptosis[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003,15(6):691-699.

[2] 俞光彥,馬大全,高巖,等.涎腺腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,40(1):7-10.

[3] Huang M, Ma D, Sun K, et al. Factors influencing survival rate in adenoid cystic carcinoma of the salivary glands[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 1997,26(6):435-439.

[4] Li Y, Guo Q, Yin G, et al. Wnt/β-catenin-signaling pathway stimulates the proliferatjon of cultured adult human Sertoli cells via upregulation of C-myc expression[J]. Reprod Sci, 2012,19(11):1232-1240.

[5] Davies C, Hogarth LA, Dietrich PA, et al. p53-independent epigenetic repression of the p21(WAF1)gene in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J]. J Biol Chem, 2011,286(43):37639-37650.

[6] Korsmeye SJ, Shutter JR, Veis DJ, et al. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulaters an anti-oxidant pathway and cell death[J]. Semin Cancer Biol, 1993,4(6):327-332.

[7] 王晶,李鑫.美洲大蠊提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2012,29(10): 876-880.

[8] Mackey TJ, Borkowski A, Amin P, et al. Bcl-2/Bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with prostate cancer[J]. Urolugy, 1998,52(6):1085-1090.

[9] 李永生,趙誠(chéng),胡釗.粉防己堿對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌BIU-87細(xì)胞裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2012,29(12):1070-1073.

[10] 張彥,賈偉麗.Bcl-2反義治療與腫瘤關(guān)系進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2011,19(2):382-385.

[11] 王琳娜,董彥宏.兩頭尖水提取物抗炎、鎮(zhèn)痛及抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的研究[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(4):154-156.

[12] 李建飛,王俊麗,公維鎮(zhèn),等.銀蓮花的抗氧化、抑菌和抗腫瘤活性[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,34(4):414-420.

[13] 王明奎,丁立生,吳鳳鍔.兩頭尖總苷的抗腫瘤活性研究[J].研究應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2008,14(3):378-382.

[14] 張爾賢,吳鳳鍔.竹節(jié)香附(Anemone Raddeana Regel)糖甙和多種天然多糖的cAMP-PDE抑制活性研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,1993,14(1):61-65.

[15] Del Poeta G, Venditti A, Del Principe MI, et al. Amount of spontaneous apoptosis detected by Bax/Bcl-2 ratio predicts outcome in acute myeloid leukemia(AML)[J]. Blood, 2003,101(6):2125-2131.

[16] 劉紅,房朝暉,李魁秀,等.卵巢癌中LPA受體、Bcl-2和Bax基因的表達(dá)和意義[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(5):677-680.

[17] Oshikawa T, Okamoto M, Ahmed SU, et al. The relationship between gene expression of Bcl-2 and Bax and the therapeutic effect in oral cancer patients[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2006,33(12):1723-1725.

陳彥平(E-mail：cyp1962@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.010

R739.85

A

1002-266X(2017)05-0033-03

2016-09-21)