顏娟，鄭茂東，崔玉環(huán)，趙秀花，班旭霞，趙虹琇

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

·基礎(chǔ)研究·

牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織能量代謝的影響

顏娟，鄭茂東，崔玉環(huán)，趙秀花，班旭霞，趙虹琇

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

目的 探討牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織能量代謝的影響。方法 將雄性昆明種小鼠60只隨機(jī)均分為6組：假手術(shù)組、模型組、(10、20、40 mg/kg)牡荊苷組、尼莫地平組。采用線栓法制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型。模型制備24 h，處死小鼠，取腦組織。用HPLC法檢測(cè)腦組織三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)，計(jì)算能荷(EC)值；用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)乳酸(LD)、乙酰膽堿酯酶(TchE)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶活力。結(jié)果 與模型組比較，尼莫地平組及10、20、40 mg/kg牡荊苷組ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)，TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P<0.05)；10、20 mg/kg牡荊苷組以上指標(biāo)與40 mg/kg牡荊苷組、尼莫地平組比較，P均<0.05，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較，P均>0.05；牡荊苷三個(gè)劑量組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 牡荊苷能改善腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織的能量代謝，且該作用呈劑量依賴性。

腦缺血；再灌注損傷；牡荊苷；能量代謝；小鼠

腦缺血是臨床常見的腦血管疾病之一，尤其腦缺血再灌注損傷是目前研究的熱點(diǎn)。腦組織中血流中斷以及再灌注引起腦組織細(xì)胞發(fā)生快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)由眾多環(huán)節(jié)組成，如腦能量代謝障礙[1]、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)[2]、興奮性氨基酸毒性[3]、細(xì)胞酸中毒[4]、炎癥細(xì)胞因子損害[5]、自由基損傷[6]及凋亡基因激活[7]等。腦是能量代謝最活躍的器官，當(dāng)腦血流供應(yīng)中斷，引起腦細(xì)胞損傷，其中腦神經(jīng)最易受損，其功能與能量代謝密切相關(guān)。三磷酸腺苷(ATP)作為腦能量的主要來源，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能起重要作用。金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有消腫明目、清熱解毒的功效。牡荊苷是金蓮花主要藥效成分，屬黃酮碳苷類化合物，具有抗氧化[8]、抗炎、抗病毒、抗癌、降壓等作用。研究表明，牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力有保護(hù)作用[9]。2016年3～6月,本研究通過線拴法制備腦缺血再灌注小鼠模型，探討牡荊苷對(duì)其腦組織能量代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥品、試劑 昆明種雄性小鼠60只，體質(zhì)量22～24 g，2月齡，由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：XCYK(冀)2010-2014。環(huán)境室溫20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水。牡荊苷(河北北方學(xué)院藥物研究所)，純度>98%；尼莫地平注射劑(河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠)；乳酸(LD)測(cè)試盒、乙酰膽堿酯酶(TchE)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、ATP酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所提供)；ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(天津一方有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物分組及腦缺血再灌注模型制備 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、(10、20、40 mg/kg)牡荊苷組、尼莫地平組，每組10只。按文獻(xiàn)[10]采用線拴法制備小鼠腦缺血再灌注模型，于術(shù)后48 h阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)，5 min后恢復(fù)血液再灌注。假手術(shù)組術(shù)中僅暴露頸總動(dòng)脈，并不進(jìn)行插線。模型制備前牡荊苷組腹腔注射不同濃度(10、20、40 mg/kg)牡荊苷、尼莫地平組腹腔注射(0.6 mg/kg)尼莫地平，均連續(xù)3 d。模型制備再灌注24 h，小鼠稱重，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，斷頭取腦，去除小腦和腦干。取腦缺血側(cè)2/3腦組織，去除樣本表面附屬物，用5%高氯酸制成10%腦勻漿，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.3 腦組織ATP、ADP、AMP及TchE、LDH、LD、ATP酶活力檢測(cè) 取腦組織上清液，加入碳酸鉀溶液0.12 mL，調(diào)pH值為中性，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，取上清液，HPLC法檢測(cè)ATP、ADP、AMP[11]，計(jì)算能荷(EC)值。EC值=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。取腦組織上清液，采用試劑盒檢測(cè)LD、TchE、LDH、ATP酶(Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP)活力。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織能量代謝指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組及10、20、40 mg/kg牡荊苷組ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)；與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組腦組織ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；牡荊苷組三個(gè)劑量組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腦組織能量代謝指標(biāo)比較

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與尼莫地平組比較,cP<0.05；與10 mg/kg牡荊苷組比較，dP<0.05；與20 mg/kg牡荊苷組比較，eP<0.05。

2.2 各組腦組織TchE、LDH、LD及ATP酶活力比較 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 mg/kg牡荊苷組TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P均<0.05)。與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P均<0.05)，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；牡荊苷三個(gè)劑量組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

3 討論

表2 各組腦組織TchE、LDH、LD及ATP酶活力比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與尼莫地平組比較，cP<0.05；與10 mg/kg牡荊苷組比較，dP<0.05；與20 mg/kg牡荊苷組比較，eP<0.05。

腦缺血后腦組織局部血流不足，導(dǎo)致大腦能量供不應(yīng)求，臨床主要表現(xiàn)為短暫性或者持久性神經(jīng)功能損傷癥狀，對(duì)人體有很大的危害。研究表明，當(dāng)腦組織血流完全阻斷時(shí)，瞬間影響腦組織神經(jīng)元代謝，接著腦電活動(dòng)停止，進(jìn)而破壞腦組織能量代謝及離子平衡，ATP大量耗竭。由于腦組織本身沒有儲(chǔ)備葡萄糖和氧氣的能力，在腦損傷后糖酵解增強(qiáng)易產(chǎn)生酸中毒，引起腦組織水腫、細(xì)胞壞死。乳酸是糖酵解終產(chǎn)物，其濃度與缺氧程度呈正相關(guān)，與腦細(xì)胞內(nèi)pH值相關(guān)，乳酸含量升高，引起pH值下降，導(dǎo)致腦膠質(zhì)細(xì)胞不可逆損害，進(jìn)而腦細(xì)胞膜上離子泵功能出現(xiàn)障礙，大量K+外流，大量Na+、Cl-和水內(nèi)流進(jìn)入腦細(xì)胞內(nèi)，則腦神經(jīng)元發(fā)生不可逆的損害[11]。腦能量代謝障礙直接反映腦神經(jīng)功能缺陷，在腦缺血模型中腦部缺血嚴(yán)重導(dǎo)致LD增加，LDH以及TchE活力下降，細(xì)胞膜上ATP酶活性降低，ATP耗竭，腦細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重受損，最終損害腦功能[12]。馬霄等[13]研究表明，半枝蓮總黃酮中劑量組可顯著提高反復(fù)腦缺血再灌注小鼠腦TchE活力和LDH活力，明顯降低小鼠腦LD水平。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織TchE、LDH活力降低，LD活力增加；牡荊苷組可顯著增加腦組織中TchE、LDH活力，降低LD活力。10、20 mg/kg牡荊苷組對(duì)TchE、LDH、LD作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無差異。

Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP是存在于生物膜上的一種蛋白酶，其生物學(xué)功能物包括能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信息轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞內(nèi)外離子平衡，也是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜功能的指標(biāo)[14]。腦缺血再灌注損傷時(shí)，細(xì)胞氧化磷酸化能力減弱，ATP合成減少，能量消耗增多，Na+-K+泵功能受阻，Na+-K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞膜對(duì) Na+和K+的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)障礙。Na+和K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)不足，激活電壓依賴性鈣通道(VDC)，引起大量Ca2+內(nèi)流，同時(shí)腦損傷后可引興奮性氨基酸囊泡大量破裂，釋放神經(jīng)遞質(zhì)，激活突觸后膜的N-甲基-D-天冬氨酸受體，使VDC開放，引起大量Ca2+內(nèi)流。Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用。腦損傷時(shí)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性也下降，Ca2+不能泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成“鈣超載”，誘發(fā)一系列病理?yè)p傷反應(yīng)，加劇繼發(fā)性腦損傷。另外膜去極化引起的過多Na+和Ca2+內(nèi)流也是腦細(xì)胞水腫產(chǎn)生的主要原因，能量代謝不足和ATP酶功能障礙是腦損傷引起的細(xì)胞損傷的重要因素[15，16]。黎曉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，染料木素磺酸鈉能增加腦缺血再灌注損傷后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP活性，改善缺血區(qū)能量代謝，減輕腦水腫及“鈣超載”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組腦組織Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低顯著；牡荊苷組可增加腦組織中Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力。10、20 mg/kg牡荊苷組對(duì)ATP酶活力作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

腦組織內(nèi)能量在維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞膜完整性、信息傳遞、遞質(zhì)釋放、合成代謝、攝取等方面起很大作用。當(dāng)腦內(nèi)血流供應(yīng)受阻、能量耗竭時(shí)，運(yùn)送到腦組織內(nèi)葡萄糖和氧將減少，導(dǎo)致有氧氧化無法順利進(jìn)行，生成的ATP減少；而且腦組織中以糖原形式存在的能量很少，進(jìn)一步引起ATP含量下降，與此同時(shí)ATP分解產(chǎn)物AMP、ADP增加后又相繼分解，最終導(dǎo)致EC值明顯下降。EC值反映高能磷酸鍵在ATP、AMP、ADP之間的相互轉(zhuǎn)化，EC值可動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞能量平衡狀態(tài)[18]。黃小平等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷和三七的主要有效成分配伍可顯著增加腦缺血再灌注小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 的量和EC值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腦組織ATP、ADP、AMP量以及EC值降低；牡荊苷組顯著增加小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP量以及EC值。10、20 mg/kg牡荊苷組對(duì)ATP、ADP、AMP水平及EC值的影響作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血再灌注引起的腦損傷具有保護(hù)作用，該作用可能與改善細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20150474)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.008

R743.31

A

1002-266X(2017)05-0026-04

2016-10-12)