焦宇知,徐 桃,梁家冰,朱 云,何志勇,張曉曉,劉永博,孫芝楊,翟瑋瑋

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇淮安 223005;2. Purdue University,West Lafayette,IN,USA,47907;3.山東省莒縣人民醫(yī)院,山東莒縣 276511;4.江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;5.山東朝能福瑞達(dá)生物科技有限公司,山東濟(jì)南 250031)

低溫脅迫小麥苗冰結(jié)構(gòu)蛋白純化的研究

焦宇知1,2,徐 桃1,梁家冰3,朱 云1,何志勇4,張曉曉1,劉永博5,孫芝楊1,翟瑋瑋1

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇淮安 223005;2. Purdue University,West Lafayette,IN,USA,47907;3.山東省莒縣人民醫(yī)院,山東莒縣 276511;4.江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;5.山東朝能福瑞達(dá)生物科技有限公司,山東濟(jì)南 250031)

以研究低溫脅迫小麥苗冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP)純化為目的,以小麥苗為對(duì)象,經(jīng)低溫脅迫,并采用粗分離、飽和硫酸銨溶液沉淀、DEAE-Cellulose 52層析、sephadex-G75凝膠層析4個(gè)步驟對(duì)其中ISP進(jìn)行純化,分別采用差示掃描量熱法(DSC)、熱休克處理法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定各純化步驟所得ISP的熱滯活性(THA)、冰晶重結(jié)晶抑制能力(ICP)和分子質(zhì)量(MW),并計(jì)算小麥苗存活率和各純化步驟的得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,梯度低溫脅迫的小麥苗存活率與恒溫低溫脅迫相比提高了240%,小麥苗提取物(AWSE)中蛋白質(zhì)含量與未低溫脅迫小麥苗提取物(NAWSE)相比提高了7.8%;以THA表征的純化倍數(shù)(T1)和以ICP表征的純化倍數(shù)(T2)分別為451.15和137.60,得率為2.85%,THA為0.180 ℃(5 mg/mL),ICP為70.03%,分子質(zhì)量范圍為20.1～31.0 ku;與THA相比,ISP在較低濃度下即可達(dá)到ICP的峰值。小麥苗可作為制備冰結(jié)構(gòu)蛋白的天然植物資源。

小麥苗,低溫脅迫,冰結(jié)構(gòu)蛋白,熱滯活性,重結(jié)晶抑制能力

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP)作為一類對(duì)冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶有抑制能力的蛋白質(zhì),可非依數(shù)性的降低溶液冰點(diǎn)而不影響其熔點(diǎn),從而引起熔點(diǎn)與冰點(diǎn)差異,這種差異被稱為熱滯活性(THA)[1]。ISP添加到冷凍面團(tuán)[2-4]、冷凍肉制品[5]和冰淇淋[6-7]等冷凍食品或原料中,可通過(guò)吸附到冰晶表面并使冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶而受到抑制,降低冰點(diǎn),從而改善冷凍食品的質(zhì)構(gòu)和原料加工特性,應(yīng)用潛力巨大。

目前已發(fā)現(xiàn)分布于植物、海洋魚(yú)類、昆蟲(chóng)和微生物中的5類ISP,且發(fā)現(xiàn)和鑒定了越來(lái)越多不同來(lái)源的ISP,如沙棘[8]、黑麥草[9]、沙冬青[10]、白斑狗魚(yú)[11]和光滑鱉甲[12]等。獲取ISP的純化方法主要有層析分離法[9]、電泳分離法[13]、冰特異性吸附分離法[14-15]、核磁共振法[16]和濁點(diǎn)萃取法[17]等。

由于ISP降低冰點(diǎn)幅度有限且產(chǎn)量小,與傳統(tǒng)食用抗凍劑相比,ISP的高成本限制了其在食品中的廣泛應(yīng)用。因此,轉(zhuǎn)基因[18]、低溫脅迫[19-21]等誘導(dǎo)ISP合成的方法和探究更為廉價(jià)的ISP來(lái)源成為研究熱點(diǎn)。植物由于原料廣泛、易得和廉價(jià),且其中的ISP具有良好的冰晶重結(jié)晶抑制能力(ICP),已成為生產(chǎn)ISP的重要原料之一[22]。小麥苗作為一種廉價(jià)易得植物,對(duì)其低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)在國(guó)內(nèi)外已有公開(kāi)報(bào)道[6,9,23]。但麥種來(lái)源和低溫脅迫條件不同,ISP結(jié)構(gòu)和活性可能有較大差異[22]。本工作擬以淮麥33為麥種,以低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生ISP,利用粗分離、飽和硫酸銨溶液沉淀、DEAE-Cellulose 52層析、sephadex-G75凝膠層析對(duì)其進(jìn)行純化,采用差示掃描量熱法(DSC)、熱休克處理法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)法分別測(cè)定純化各步驟所得ISP的THA、ICP和分子質(zhì)量,計(jì)算低溫脅迫小麥苗存活率以篩選最優(yōu)低溫脅迫方法,計(jì)算各純化步驟的得率以評(píng)價(jià)純化效果,以期為小麥苗來(lái)源的ISP開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淮麥33 淮安市農(nóng)科院提供;DEAE-Cellulose 52、考馬斯亮藍(lán)G250、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 美國(guó)sigma;sephadex-G75 瑞典Pharmacia公司;雞蛋清溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑、牛碳酸酐酶、兔肌動(dòng)蛋白、牛血清白蛋白、兔磷酸化酶B 上海普欣生物科技公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘油、過(guò)硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硫酸銅、硫酸鉀、氯化鉀、硫酸、溴酚藍(lán)、硫酸銨、鹽酸等 國(guó)藥集團(tuán);透析膜上海生工生物,截留分子質(zhì)量MWCO 3.5 ku。

DSC-7差熱分析儀 美國(guó)PE公司;GTOP-158D光照培養(yǎng)箱 浙江托普儀器公司;DW-86L288超低溫冰箱 海爾公司;CX41顯微鏡、DP20成像系統(tǒng) 日本OLYMPUS公司;HCS410冷熱臺(tái) 美國(guó)INSTEC;GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;K9840/SH220N凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器公司;HDB-3紫外檢測(cè)儀、TH-1000梯度混合器、EBS-20自動(dòng)部份收集器和記錄儀 上海滬西儀器廠;FD-1臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 上虞艾科儀器公司;BG垂直電泳儀 北京百晶生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥苗的低溫脅迫 參照文獻(xiàn)[6]的方法稍作改動(dòng)。小麥苗長(zhǎng)至一葉一心后,采用梯度低溫脅迫,降溫至8 ℃培育24 h,然后降至6 ℃培育48 h,再降至4 ℃培育96 h,晝夜溫度一致。解除低溫脅迫72 h后取小麥苗并超低溫保存?zhèn)溆?以未低溫脅迫處理的小麥苗和4 ℃低溫脅迫168 h作為對(duì)照。以解除低溫脅迫后72 h后恢復(fù)長(zhǎng)勢(shì)的小麥苗計(jì)算存活率(SR)。

其中:NR為解除低溫脅迫后72 h后恢復(fù)長(zhǎng)勢(shì)的小麥苗數(shù),NNCA為低溫脅迫前小麥苗數(shù)。

1.2.2 小麥苗初提物(AWSE)的制備 每次稱取150 g超低溫小麥苗,加 600 mL預(yù)冷緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl,pH7.8,0.1 mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,0.1 mol/L KCl),攪拌粉碎,提取液于13000 r/min條件下冷凍離心30 min,上清液75 ℃水浴15 min后,于冰水浴中冷卻,13000 r/min冷凍離心30 min,上清液冷凍干燥得AWSE,用同樣方法制備未低溫脅迫小麥苗初提物(NAWSE)。

1.2.3 飽和硫酸銨溶液沉淀初分離 AWSE復(fù)溶后用100%飽和度的硫酸銨溶液4 ℃低溫沉淀10 h后,于13000 r/min條件下冷凍離心15 min。沉淀用超純水復(fù)溶,用透析膜(MWCO 3.5 ku)對(duì)純水透析過(guò)夜后濃縮凍干。

1.2.4 DEAE-Cellulose 52層析 參照文獻(xiàn)[24]方法并作改動(dòng)。層析柱(2.5 cm×45 cm)經(jīng)緩沖液(5 mmol/L Tris-HCl,pH7.8,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mol/L KCl)平衡后,用緩沖液配制20 mg/mL的樣品,經(jīng)0.45 μm 微濾膜過(guò)濾后進(jìn)行離子交換層析:上樣量5 mL,先用25 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH7.8)洗脫1 h,再用0～1 mol/L的KCl溶液(含5 mmol/L Tris-HCl,pH7.8,0.1 mmol/L EDTA)進(jìn)行梯度洗脫,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,收集熱滯活性組分,對(duì)純水透析過(guò)夜后濃縮凍干。

1.2.5 Sephadex-G75凝膠層析 參照文獻(xiàn)[25]方法并作改動(dòng)。經(jīng)離子交換層析純化后的凍干樣品20 mg溶于0.5 mL洗脫液中(5 mmol/L Tris-HCl,pH7.8,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mol/L KCl)中,經(jīng)0.45 μm微濾膜過(guò)濾后進(jìn)行凝膠層析:層析柱(1.5 cm×50 cm)先用洗脫液充分平衡,上樣量0.5 mL,流速0.2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,收集熱滯活性組分,對(duì)純水透析過(guò)夜后濃縮凍干。

1.2.6 THA測(cè)定 采用DSC法測(cè)定,參照文獻(xiàn)[26]方法并作改動(dòng)。取經(jīng)離子交換和凝膠層析純化的ISP組分各5 mg,用1 mL蒸餾水復(fù)溶,取10μL溶液密封于鋁制坩堝中,置于DSC儀器樣品池中央,以空池為參比。儀器穩(wěn)定后,首先以1 ℃/min降溫至-25 ℃,然后升溫至25 ℃,再降溫至-25 ℃,從掃描曲線上得到結(jié)晶溫度(Tf,結(jié)晶放熱峰起始點(diǎn)溫度)、體系結(jié)晶熱(ΔAm)和熔點(diǎn)(Tm,熔化吸熱峰值溫度)。以1 ℃/min升溫至保持溫度(Th,樣品熔融峰所涵蓋溫度區(qū)間的某一溫度),Th保持5 min后再降溫至-25 ℃。記錄掃描曲線上結(jié)晶放熱峰初始溫度T0和體系結(jié)晶熱(ΔAf)。設(shè)定ΔAf為60%±10%時(shí)的Th為實(shí)驗(yàn)保留溫度。冰晶含量(φ)的計(jì)算公式和熱滯活性THA計(jì)算公式分別如下:

THA=Th-T0

1.2.7 ICP測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]方法并稍作改動(dòng)。冰淇淋中AWSE和NAWSE添加量均為10 mL(5 mg/mL),其與水的總體積保持75 mL不變,以基礎(chǔ)配方為對(duì)照。冰淇淋硬化后置于程序制冷器中,待冰淇淋升溫至-20 ℃后進(jìn)行熱休克處理,以1.67 ℃/h加熱至-10 ℃后保溫42 h,再以相同的速度冷卻至-20 ℃并保溫42 h,每周期共96 h,8個(gè)周期后測(cè)定熱休克始末冰淇淋冰晶大小均值X50,冰晶大小增長(zhǎng)百分比(IGP)定義為熱休克處理周期末與周期始相比X50增加百分比;小麥苗ICP定義為與參照物水相比AWSE降低IGP的百分比,ICP計(jì)算公式如下:

1.2.8 ISP分子質(zhì)量測(cè)定 采用SDS-PAGE電泳法,參照文獻(xiàn)[27]方法并作改動(dòng)。樣品的制備:凝膠層析純化后凍干樣品10 mg溶于1 mL蒸餾水,10000 r/min離心5 min,取50 μL上清液加等體積樣品緩沖液,沸水浴3 min后取出立刻離心并取上清液。濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%。

1.2.10 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照GB 5009.5-2010采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用IBM SPSS 20和OriginPro 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)小麥苗存活率的影響結(jié)果分析

與對(duì)照組相比,低溫脅迫處理后,小麥苗雖出現(xiàn)枯萎或長(zhǎng)勢(shì)明顯下降的現(xiàn)象(表1),但采用梯度低溫脅迫后,仍有76.8%的小麥苗存活并在測(cè)定期內(nèi)恢復(fù)長(zhǎng)勢(shì);與4 ℃恒溫低溫脅迫相比,梯度低溫脅迫小麥苗存活率顯著提高(表1,p<0.05),相比較提高了240%。由于恒溫低溫脅迫小麥苗的存活率低,后期實(shí)驗(yàn)未將其作為研究對(duì)象。梯度低溫脅迫后,AWSE的蛋白質(zhì)含量顯著上升(表1,p<0.05),相比較提高了7.8%。原因可能是,蛋白質(zhì)作為植物細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)之一,在低溫脅迫下可通過(guò)調(diào)節(jié)滲透濃度從而啟動(dòng)脫落酸的形成,誘發(fā)新蛋白質(zhì)的合成以提高抗寒性[28]。研究者常使用體內(nèi)標(biāo)記和mRNA 體外翻譯等方法分離出低溫誘導(dǎo)蛋白并獲得其氨基酸序列,從而篩選出特異性基因用于作物抗凍性能和材料冷凍儲(chǔ)藏性能的改良[29]。

表1 低溫脅迫對(duì)小麥苗存活率和AWSE蛋白質(zhì)含量的影響Table 1 Changes of survival rate of wheat seedling and protein content in AWSE after chilling stress

注:abcde值同一列不同字母差異性顯著(p<0.05),數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，表2～表4同。

2.2 小麥苗ISP分離純化結(jié)果分析

2.2.1 各純化階段得率和純化倍數(shù)結(jié)果分析 AWSE經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨沉淀、離子交換和凝膠層析等純化步驟后,ISP得率達(dá)到2.85%。以THA表征的純化倍數(shù)T1和以ICP表征的純化倍數(shù)T2分別為451.15和137.60(表2),兩者存在較大差異的原因可能是AWSE初提物中ISP濃度低從而導(dǎo)致DSC儀器測(cè)定中取值方式的誤差增加。由于除初始冰晶含量和一定范圍內(nèi)蛋白濃度等部分可控因素對(duì)ISP的THA測(cè)定結(jié)果有一定影響外,THA測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定,因此,本工作仍將THA變化作為純化倍數(shù)的計(jì)算依據(jù)之一。有研究表明,低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ISP熱穩(wěn)定性高[30-31],因此本實(shí)驗(yàn)在制備AWSE時(shí),加熱處理去除了部分熱不穩(wěn)定蛋白,為ISP的后續(xù)純化提供了便利,理論上提高了純化倍數(shù)。

經(jīng)低溫脅迫后,AWSE初提物的質(zhì)量高于NAWSE初提物(表2),表明低溫脅迫誘導(dǎo)了新蛋白的合成,這與2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

凝膠層析后的AWSE在5 mg/mL時(shí)THA達(dá)到了0.180 ℃,與Jia Chunli等[32]報(bào)道植物源ISP的活性在0.1～0.6 ℃之間一致。隨著純化的進(jìn)行,AWSE中ISP濃度升高,THA也隨之增加,表明ISP降低溶液冰點(diǎn)雖具有非依數(shù)性,ISP的THA與其濃度仍有一定的關(guān)系,這與張暉等[33]報(bào)道ISP非依數(shù)性約為具有依數(shù)活性物質(zhì)的500倍,但在一定濃度范圍內(nèi)THA隨濃度緩慢變化的結(jié)果一致[27]。

純化過(guò)程中,ISP的ICP從AWSE初提物的17.83%增加至離子交換層析純化后的69.65%(表2,p<0.05)。表明隨著ISP濃度增加,AWSE對(duì)冰晶重結(jié)晶抑制能力顯著增強(qiáng)。凝膠層析后,AWSE中的ISP濃度進(jìn)一步增加,但其ICP增加不顯著(p>0.05),說(shuō)明ISP的非依數(shù)性存在極限濃度,達(dá)到該濃度時(shí),其活性趨于飽和[33]。

表2 AWSE純化過(guò)程參數(shù)變化Table 2 Variation of parameters during purification process of AWSE

注:停留溫度Th=-2.00 ℃。表3、表4同。

原因可能是,根據(jù)“吸附-抑制”模型和“石頭壓海綿”模型理論,ISP分子在與冰淇淋冰晶表面結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致冰晶局部表面曲率發(fā)生變化,覆蓋的ISP分子之間存在尺度空間,覆蓋率無(wú)法達(dá)到100%,同時(shí)冰淇淋冰晶分子表面積本身也有限,從而導(dǎo)致ISP的THA和ICP都存在閾值。與ISP的THA活性相比,AWSE的ISP在相對(duì)較低濃度下即可達(dá)到ICP最大值,因此可預(yù)測(cè)AWSE抑制冰晶重結(jié)晶能力要比其熱滯活性更高,這與Hassas-Roudsari M等[1]報(bào)道一致,植物來(lái)源ISP主要作用不是阻止冰晶形成,而是抑制重結(jié)晶和降低過(guò)冷點(diǎn)[9,22]。經(jīng)過(guò)8個(gè)周期的熱休克處理后,NAWSE也檢測(cè)出1.33%的ICP,可能是由于NAWSE的加入導(dǎo)致冰淇淋混合溶液冰點(diǎn)下降。

2.2.2 離子交換層析分離純化結(jié)果分析 飽和硫酸銨沉淀所得AWSE在離子交換色譜圖上出現(xiàn)8個(gè)洗脫峰(圖1)。其中,P1、P2和P3與飽和硫酸銨沉淀初分離后AWSE相比,THA顯著增加,ICP顯著增加并接近或達(dá)到最高值(表3)。AWSE所含ISP在120 min內(nèi)即可洗脫完全,這與公開(kāi)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果不完全一致[34],這可能與小麥苗品不同有關(guān),另外低溫脅迫方法不同誘導(dǎo)產(chǎn)生的ISP的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可能也存在較大差異[22],從而導(dǎo)致離子交換特性發(fā)生變化。P4的THA和ICP較無(wú)活性的P5～P8要高(表3),可能是由于組分分步收集時(shí),微量P3組分混入P4所致,也有可能是DSC儀器測(cè)定中取值方式的誤差所致。

圖1 AWSE離子交換層析圖Fig.1 Ion exchange chromatography profile of AWSE

表3 AWSE離子交純化后參數(shù)變化Table 3 Parameters variation after purification of AWSE by ion exchange chromatography

2.2.3 凝膠層析分離純化結(jié)果分析 對(duì)離子交換色譜獲得的P1、P2和P3(圖1)進(jìn)行凝膠層析分離后。P13、P23和P33顯示出THA和ICP(圖2～圖4)。與凝膠色譜純化前相比,THA顯著增加,ICP達(dá)到飽和(表4)。電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,P13、P23和P33的洗脫時(shí)間雖然存在差異,但電泳結(jié)果顯示P13、P23、P33分子質(zhì)量范圍相同,為20.1～31.0 ku(圖5),這與公開(kāi)報(bào)道的結(jié)果20～40[9]和20～34 ku[34]一致但不完全相同,可能與麥種和低溫脅迫方法的不同導(dǎo)致誘導(dǎo)產(chǎn)生的ISP不同有關(guān)系。P13、P23略有拖尾現(xiàn)象,可能是因?yàn)闃悠肥蔷哂邢嘟鄬?duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)混合物,也可能是由于在濃縮膠中蛋白質(zhì)濃度過(guò)高而導(dǎo)致沉淀。P12、P22和P32的THA和ICP較P11、P21和P31高(表4),可能是由于分步收集時(shí),微量活性組分混入P12、P22和P32所致,也有可能是DSC儀器測(cè)定中取值方式的誤差所致。

圖2 P1凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatography profile of P1

圖3 P2凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography profile of P2

圖4 P3凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatography profile of P3

表4 AWSE凝膠層析純化后參數(shù)變化Table 4 Parameters variation during purification of AWSE by iron exchange chromatography

圖5 凝膠層析后AWSE各活性峰電泳圖Fig.5 SDS-PAGE profile of P13、P23和P33 after gel filtration of AWSE

3 結(jié)論

以低溫脅迫小麥苗為對(duì)象,采用粗分離、飽和硫酸銨溶液沉淀、DEAE-Cellulose 52層析、sephadex-G75凝膠層析對(duì)其中的ISP進(jìn)行純化,測(cè)定了純化過(guò)程中樣品的THA、ICP和分子質(zhì)量,計(jì)算了小麥苗存活率和各純化步驟的得率。梯度低溫脅迫小麥苗存活率與恒溫低溫脅迫相比提高了240%,AWSE中蛋白質(zhì)含量與NAWSE相比提高了7.8%;以THA表征的純化倍數(shù)(T1)和以ICP表征的純化倍數(shù)(T2)分別為451.15和137.60,得率為2.85%,THA為0.180 ℃(5 mg/mL),ICP為70.03%,分子質(zhì)量(MW)范圍為20.1～31.0 ku;與THA相比,ISP在較低濃度下即可達(dá)到ICP的峰值。

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Studies on purification of ice structuring protein from cold-acclimated wheat seedlings

JIAO Yu-zhi1,2,XU Tao1,LIANG Jia-bing3,ZHU Yun1,HE Zhi-yong4,ZHANG Xiao-xiao1,LIU Yong-bo5,SUN Zhi-yang1,ZHAI Wei-wei1

(1.Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College,Huai’an 223005,China;2.Purdue University,West Lafayette,IN,USA,47907;3.Civil Hospital of Juxian,Juxian 276511,China;4.Jiangnan University,Wuxi 214122,China;5.Chaoneng Freda Bio Co. Ltd.,Jinan 250031,China)

To investigate purification of ice structuring protein(ISP)from cold-acclimated wheat seedlings,wheat seedlings underwent cold acclimation and ISP from cold-acclimated wheat seedlings was purified by 4 sequential steps including coarse separation,saturated ammonium sulphate precipitation,DEAE-Cellulose 52 chromatography and sephadex-G75 gel filtration chromatography. Differential scanning calorimetry(DSC),heat shock treatments and polyacrylamide gel electro-phoresis(SDS-PAGE)were employed respectively for determination of thermal hysteresis activity(THA),ice recrystallization inhibition power(ICP)and molecular weight(MW)of ISPs during process of purification. Survival rate of cold-acclimated wheat seedlings and purification times of ISP during each purification step were calculated as well. Results showed an increase of 240% in survival rate of wheat seedlings using gradient cold-acclimation compared with constant cold-acclimation. Protein content of cold-acclimated wheat seedlings extract(AWSE)was increased by 7.8% in comparison to non-cold-acclimated wheat seedlings extract(NAWSE). Eventual purification times based on THA and ICP were 451.15 and 137.60 respectively. Yield,THA at 5 mg/mL,ICP and MW range of ISP were 2.85%,0.180 ℃,70.03% and 20.1～31.0 ku respectively. Maximal ICP of ISP was achieved at lower concentration compared with THA. Wheat seedlings can be a potential plant resource in production of ISP.

wheat seedlings;cold-acclimation;ISP;THA;ICP

2016-09-29

焦宇知(1979-)，男，碩士，副教授,研究方向：植物功能因子開(kāi)發(fā),E-mail：ningmen3749574@163.com。

淮安市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新計(jì)劃(HAC2015006)；江蘇省“青藍(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃(蘇教師(2014)23號(hào))；淮安市食品技術(shù)研究院(HAP201301)；江蘇省首批高校優(yōu)秀中青年教師境外研修計(jì)劃(蘇教師[2011]34號(hào))；企業(yè)委托橫向項(xiàng)目(蘇食院合字(2015)432號(hào))。

TS229

A

:1002-0306(2017)03-0102-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.011