趙超綺,楊文君,王元香,林 棟,孫雪梅,趙 芹,*

(1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院,山東煙臺 264025;2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺 264003)

革皮氏海參總皂苷提取物抗腫瘤作用研究

趙超綺1,楊文君1,王元香1,林 棟2,孫雪梅1,趙 芹1,*

(1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院,山東煙臺 264025;2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺 264003)

目的:探討革皮氏海參總皂苷(Total triterpene glycosides fromPearsonothuriagraeffei,TGPG)的抗腫瘤作用。方法:采用MTT法檢測TGPG對小鼠肉瘤細(xì)胞系S180、人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2和人宮頸癌細(xì)胞系Hela的生長抑制作用。建立S180實體瘤小鼠動物模型,評價TGPG對S180肉瘤的生長、免疫器官指數(shù)和機體氧化水平的影響。結(jié)果:TGPG在體外可顯著抑制腫瘤細(xì)胞S180、Caco-2和Hela的細(xì)胞活力,且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。TGPG在體內(nèi)能顯著抑制S180肉瘤的生長,平均抑瘤率為47.01%;顯著提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(p<0.05);顯著提高荷瘤小鼠血清和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的活力(p<0.05)以及還原型谷胱甘肽(GSH)的含量(p<0.05)。結(jié)論:TGPG可通過提高機體的免疫能力和抗氧化水平,抑制體內(nèi)外腫瘤的生長。

海參總皂苷,抗腫瘤,S180細(xì)胞,免疫,抗氧化

海參皂苷是海參的次生代謝產(chǎn)物,屬于三萜皂苷類化合物,是海參體壁中重要的生物活性成分之一,已被證實具有抑菌[1],促進造血[2],調(diào)節(jié)膽固醇代謝[3]和降血壓[4]等生理活性。由于生存環(huán)境和攝食不同,不同海參體內(nèi)的皂苷成分組成和結(jié)構(gòu)不同,因而具有不同的生物活性。大量研究發(fā)現(xiàn)多種海參皂苷,如米氏海參(Holothuriamoebii)[5]、黑海參(HolothuriaatraJaeger)[6]和黃疣海參(Holothurianobilis)[7]等皂苷均具有良好的抗腫瘤活性。

革皮氏海參(Pearsonothuriagraeffei)分布在我國臺灣和南沙群島以及馬達加斯加、馬爾代夫群島、菲律賓、關(guān)島和斐濟群島等地,其體壁較厚,味苦麻舌,食用價值較低,但是皂苷含量高達3.514%[8],遠(yuǎn)高于其他種類海參,如白肛海地瓜(0.19%)、玉足海參(0.92%)、梅花參(1.36%)和黃疣海參(0.87%)等[9]。目前對革皮氏海參總皂苷的活性研究主要集中在提高免疫力[10]、促進骨髓造血[11]等,對其抗腫瘤活性及其機制仍缺乏系統(tǒng)的研究。因此本實驗以革皮氏海參總皂苷提取物(TGPG)為研究對象,對其體內(nèi)外抗腫瘤活性進行全面的評價,為深入挖掘海參皂苷的保健價值,促進低值海參的高值化利用和功能性食品的開發(fā)打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

革皮氏海參(P.graeffei) 市售,由中國科學(xué)院海洋研究所廖玉麟研究員對樣品進行種屬鑒定;小鼠肉瘤S180細(xì)胞株和人宮頸癌細(xì)胞系Hela 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所;人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2 美國ATCC;Balb/c雄性小鼠,(20±2) g 北京維通利華動物有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基、新生牛血清 美國GIBCO公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Amresco公司;環(huán)磷酰胺 上海華聯(lián)制藥有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司產(chǎn)品;TS-100型倒置生物顯微鏡 日本Nikon公司;680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 革皮氏海參總皂苷的制備 參照文獻[8],將1 kg干品革皮氏海參粉碎后,在室溫條件下采用60%的乙醇溶液以1∶30(w/v)的料液比提取3次。提取液合并濃縮得流浸膏。以水分散后過HP-20型大孔樹脂,并依次用水、80%乙醇及100%乙醇洗脫。收集80%乙醇洗脫的組分,旋蒸后得到TGPG 109.6 g。采用香草醛-冰乙酸比色法測得TGPG中皂苷含量約為65%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) S180和Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,Caco-2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基,其中均含2%的青/鏈霉素。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.3 對腫瘤細(xì)胞活力的影響 收集對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞,按照S180(5×104/mL)、Caco-2(2.5×104/mL)和Hela(2×104/mL)調(diào)整細(xì)胞密度,以100 μL/孔接種于96孔板。S180于接種細(xì)胞的同時加入不同濃度受試物;Caco-2和Hela貼壁培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,再加入含不同濃度受試物的完全培養(yǎng)基,其中正常對照組不加樣品,每組4個復(fù)孔,培養(yǎng)時間為24、48、72 h。采用MTT法[12]測定吸光度OD570值,按公式(1)計算各組細(xì)胞活力。

式(1)

1.2.4 對小鼠移植S180肉瘤的抑制作用 S180細(xì)胞以腹水型在體內(nèi)傳代3次后,于接種后6 d在無菌條件下抽取小鼠腹水,以無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106/mL。Balb/c小鼠于右前肢腋窩皮下接種0.2 mL制備的S180腫瘤細(xì)胞懸液。次日隨機分組,即:正常對照組,不接種腫瘤細(xì)胞;模型對照組,灌胃生理鹽水0.1 mL/(10 g·bw);陽性對照組,灌胃環(huán)磷酰胺(25 mg/kg·bw);TGPG低、中、高劑量組,TGPG的灌胃劑量分別為10、20、40 mg/kg·bw,每組10 只。接種24 h后開始灌胃,1次/d,連續(xù)21 d。末次給藥后,禁食不禁水12 h后,摘眼球取血,脫頸椎處死動物。離心收集血清置于-80 ℃冰箱凍藏備用;剪開腫瘤部位皮膚,剝離腫瘤、以濾紙吸凈其上液體,稱重,并計算抑瘤率。同時分離胸腺和脾臟,稱重,計算臟器指數(shù)。摘取肝臟投入液氮中,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍藏備用。

式(2)

式(3)

1.2.5 血清中GSH-PX、GST酶活力和GSH含量的測定 取出凍存于-80 ℃冰箱的血清樣本,參照相應(yīng)試劑盒說明檢測血清中GSH-PX、GST活力和GSH含量。

1.2.6 肝臟GSH-PX、GST酶活力和GSH含量的測定 取0.3 g肝臟,以預(yù)冷生理鹽水漂洗后,按肝臟∶生理鹽水=1∶9(w/v)比例加入預(yù)冷生理鹽水,冰浴條件下研磨成10%肝臟勻漿。4 ℃下以8000 r/min離心15 min,取上清,參照相應(yīng)試劑盒說明測定肝臟勻漿中GSH-PX、GST活力和GSH含量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析,同時采用LDS法進行兩兩比較,以p<0.05為差異有顯著性,p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGPG對腫瘤細(xì)胞存活率的影響

TGPG對3種腫瘤細(xì)胞活力的影響如圖1所示。經(jīng)4 μg/mL以上的TGPG處理后,S180、Caco-2和Hela細(xì)胞的生長均受到顯著的抑制,且樣品處理時間越長,抑制作用越強。其中,在樣品作用72 h后,TGPG對S180、Caco-2和Hela細(xì)胞存活率的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為8.17、10.78和9.03 μg/mL,表明其對懸浮腫瘤細(xì)胞和貼壁腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活均具有顯著的抑制作用。高子陽[9]等研究了我國11種不同種類市售海參和8批革皮氏海參干燥體壁中的總皂苷含量,結(jié)果顯示TGPG含量3.16%～5.27%之間,遠(yuǎn)高于其他種類海參。以上結(jié)果表明,革皮氏海參皂苷不僅含量高,而且抑制腫瘤增殖的活性也較強,是一種優(yōu)良的海參皂苷來源物種。

2.2 TGPG對荷瘤小鼠腫瘤組織生長的影響

由表1可見,與正常對照組相比,模型組小鼠S180肉瘤生長旺盛,平均瘤重達2.51 g,表明模型建立成功。灌胃不同劑量的TGPG后,各組小鼠的腫瘤生長均受到顯著的抑制,其中中劑量組平均抑瘤率達57.77%,顯著優(yōu)于環(huán)磷酰胺組(p<0.05)。高劑量組抑瘤率同中劑量組相比,呈現(xiàn)下降的趨勢,推測是海參皂苷劑量過高,以致本身的細(xì)胞毒性對機體產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響。

表1 革皮氏海參總皂苷提取物對小鼠S180肉瘤生長的影響Table 1 Effects of TGPG on S180 tumor growth

注:與正常對照組比較,##p<0.01;與模型對照組比較,**p<0.01。

2.3 TGPG對荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機體重要免疫器官,其與體重的比值可直接反映機體的免疫功能。由表2可見,同正常對照組相比,模型組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著下降(p<0.01),表明接種腫瘤以后,機體的免疫功能受到嚴(yán)重的影響。本實驗中陽性對照組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低(p<0.05),說明抗癌藥物環(huán)磷酰胺在腫瘤治療過程中會損傷機體的免疫系統(tǒng),降低小鼠的免疫功能。與模型對照組相比,低、中劑量的TGPG均能顯著提高小鼠的胸腺和脾臟指數(shù),且中劑量效果最為顯著。高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比中劑量組低,推測是海參皂苷劑量過高導(dǎo)致機體呈現(xiàn)一定毒作用。以上結(jié)果表明,革皮氏海參皂苷也具有顯著提高免疫器官的指數(shù),在小鼠腫瘤的治療過程中,可有效改善腫瘤導(dǎo)致的免疫功能低下,提高S180荷瘤小鼠的免疫機能。

表2 革皮氏海參總皂苷提取物對S180荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effects of TGPG on thymus and spleen index of S180 tumor-bearing mice

注:與正常對照組比較,##p<0.01;與模型對照組比較,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 TGPG對荷瘤小鼠血清中GSH-PX、GST酶活力和GSH含量的影響

GSH是一種維持生物體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的小分子活性寡肽,對清除活性氧和維持體內(nèi)巰基平衡具有重要的作用[12]。GSH-PX可將GSH氧化成GSSG,同時將H2O2還原成H2O,阻斷·OH的生成。GST作為機體重要的II相解毒酶,既可直接清除ROS自由基,也可催化GSH與親電子化合物的結(jié)合,促進其排出體外[13]。

如圖2所示,與正常組相比,荷瘤小鼠血清中GSH-PX、GST酶活力和GSH含量均顯著下降,表明腫瘤的生長導(dǎo)致機體氧化還原失衡。灌胃不同劑量TGPG后,各組小鼠血清中GSH-PX、GST酶活力和GSH含量同模型組相比均顯著升高,其中中劑量組分別提高了9.14%、10.08%和31.25%,推測中劑量的海參皂苷既能改善機體的氧化還原狀態(tài),又不至于造成細(xì)胞毒性,因此效果最為顯著(p<0.05)。

圖2 革皮氏海參總皂苷提取物對荷瘤小鼠血清中GSH-PX、GST和GSH水平的影響Fig.2 Effects of TGPG on the serum activities of GSH-PX,GST,and levels of GSH in tumor-bearing mice

2.5 TGPG對荷瘤小鼠肝臟中GSH-PX、GST酶活力和GSH含量的影響

由圖3可見,同血清中的結(jié)果類似,模型小鼠肝臟內(nèi)的抗氧化酶和GSH的含量較正常小鼠均顯著降低(p<0.01),表明荷瘤小鼠機體氧化還原平衡狀態(tài)受到破壞。與模型組相比,各劑量組小鼠肝臟中的GSH-PX、GST和GSH水平均有不同程度的提高,其中中劑量組效果最優(yōu)(p<0.05),分別提高了20.70%、22.75%和123.13%。以上結(jié)果表明,TGPG對腫瘤生長的抑制作用,可能與其提高血清和肝臟中抗氧化酶活力,抑制機體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

圖3 革皮氏海參總皂苷提取物對荷瘤小鼠肝臟中GSH-PX、GST和GSH水平的影響Fig.3 Effects of TGPG on the levels of GSH-PX,GST and GSH in the liver of tumor-bearing mice

3 結(jié)論

本實驗研究發(fā)現(xiàn),革皮氏海參皂苷含量豐富,且其體外抑制多種腫瘤的增殖活性顯著優(yōu)于其他海參,可作為海參皂苷良好的生物來源。革皮氏海參總皂苷抗腫瘤的功能可能與其提高機體的免疫能力和抗氧化水平相關(guān)。本研究為革皮氏海參皂苷在預(yù)防和治療腫瘤中的應(yīng)用提供了理論依據(jù),同時也為低值海參中生物活性物質(zhì)的高值化利用提供了新的思路。革皮氏海參皂苷抗腫瘤作用的分子機制及其單體成分的結(jié)構(gòu)鑒定仍需進一步研究。

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Anti-tumor effects of total triterpene glycosides fromPearsonothuriagraeffei

ZHAO Chao-qi1,YANG Wen-jun1,WANG Yuan-xiang1,LIN Dong2,SUN Xue-mei1,ZHAO Qin1,*

(1.School of Food Engineering,Lu Dong University,Yantai 264025,China;2.School of pharmacy,Binzhou Medical University,Yantai 264003,China)

Objective:The aim of this study was to investigate the anti-tumor effects of total triterpene glycosides fromPearsonothuriagraeffei(TGPG). The effects of TGPG on the viability of three tumor cell lines,S180,Caco-2 and Hela were measured by MTT methods. Theinvivosolid S180 tumor-bearing mice models were established to investigate tumor inhibitory,immune regulation and antioxidant effect of TGPG. The results indicated that TGPG could inhibit the growth of S180,Caco-2,and Hela cellsinvitroobservably in a dose-and time-dependent manner. TGPG could inhibit the growth of S180 tumorinvivo,and the average tumor inhibition rate was 47.01%. TGPG could also increase the spleen and thymus indexes(p<0.05),promote the activities of GSH-PX and GST(p<0.05)and increase the contents of GSH(p<0.05)both in serum and liver remarkably. In summary,TGPG can inhibit the tumor growthinvitroandinvivothrough immune regulation and antioxidative effect.

total triterpene glycosides of sea cucumber;anti-tumor;S180 cells;immune;antioxidative

2016-08-19

趙超綺(1994-)，男，在讀大學(xué)本科，研究方向：食品營養(yǎng)學(xué)，E-mail:907800517@qq.com。

*通訊作者:趙芹(1983-)，女，博士，講師，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)，E-mail:candyffff@163.com。

山東省自然基金(ZR2015PC002；ZR2014BP016)；魯東大學(xué)人才引進基金(LY2012011)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610451336)。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)03-0353-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.060