馬茹男,翟飛紅,劉紅艷,韓建榮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

姬松茸固態(tài)發(fā)酵對小麥多酚的影響

馬茹男,翟飛紅,劉紅艷,韓建榮*

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

為研究姬松茸固態(tài)發(fā)酵對小麥多酚的影響并初步探索其代謝機理,對姬松茸固態(tài)發(fā)酵后小麥的多酚物質(zhì)(游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚和總酚)含量和3種碳水化合物水解酶(纖維素酶、α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶)酶活性進行了測定,并對它們之間的關(guān)系進行了研究。結(jié)果表明,游離態(tài)多酚和總酚含量隨發(fā)酵時間的延長而增加,均在發(fā)酵30 d時達到最大,分別為3.121 mg/g和3.207 mg/g。結(jié)合態(tài)多酚含量隨發(fā)酵時間的延長而降低。纖維素酶和α--淀粉酶的酶活性隨發(fā)酵時間的延長而增加,在發(fā)酵第20 d達到最大,之后逐漸降低。β--葡萄糖苷酶的酶活在5～30 d的發(fā)酵時間內(nèi)一直隨發(fā)酵時間延長而增加。3種酶對結(jié)合態(tài)多酚從細胞壁釋放出來起重要作用。

姬松茸,小麥,多酚,碳水化合物水解酶

近年來,全谷物作為一種新的養(yǎng)生概念愈來愈受到關(guān)注。全谷物的攝入有助于降低心臟病,胃腸道癌癥,糖尿病的風(fēng)險,防止虛胖,增強抵抗力。全谷物之所以具備這些保健功能,與其含有豐富的酚類化合物密切相關(guān)[1]。有研究表明,全谷物中含有大量的多酚類化合物,包括酚酸、黃酮類化合物和原花青素等,具有很強的抗氧化活性[2-3]。根據(jù)其與蛋白質(zhì)、糖類等的結(jié)合程度分為結(jié)合型多酚和游離型多酚[4]。這些酚類化合物多集中在胚芽、麩、糠部位,而在胚乳部含量較少,不利于人體消化吸收利用[1,5]。傳統(tǒng)的食用習(xí)慣是對谷物精制脫皮,使得大部分多酚化合物在加工過程中隨種皮分離損失掉。有報道稱[6-9],利用碳水化合物水解酶的水解作用,使谷物細胞壁分解,各種活性物質(zhì)釋放或合成,能提高多酚的得率。

小麥?zhǔn)侨藗內(nèi)粘Ｉ钪凶钪匾墓任镏?它的麩、糠部位不僅是膳食纖維的重要來源,更是富含酚酸類化合物,包括香草酸、香豆酸、阿魏酸等[4,7]。

姬松茸(AgaricusblazeiMurrill)又名巴西蘑菇,是一種珍稀的食藥兼用真菌[10]。因其含有甾醇,多糖等功效成分,在防癌、抗腫瘤、降低血糖等方面具有顯著效果[11]。目前,利用食用菌菌絲體在谷物上發(fā)酵的研究尚少[12]。本實驗利用姬松茸對小麥進行固態(tài)發(fā)酵,研究姬松茸固態(tài)發(fā)酵對小麥游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚、總酚含量的影響,并對發(fā)酵產(chǎn)物的α-淀粉酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶酶活進行測定,探索這3種碳水化合物水解酶與結(jié)合態(tài)多酚的關(guān)系。旨在研究姬松茸固態(tài)發(fā)酵對小麥多酚的影響并初步探索其代謝機理,為開發(fā)新的食藥兼用的粗糧發(fā)酵食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姬松茸(Agaricusblazei)SH26菌株由本實驗室提供,小麥從市場上購買。

沒食子酸 Sigma公司;福林酚 北京索萊寶科技有限公司;石油醚;甲醇;乙酸乙酯;氫氧化鈉;3,5-二硝基水楊酸(DNS);酒石酸鉀鈉;結(jié)晶酚;亞硫酸鈉;可溶性淀粉;對硝基苯酚;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)。

生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;低速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 谷物培養(yǎng)基的制備及固態(tài)發(fā)酵

準(zhǔn)確稱取400 g(干重)除去谷殼和石子等雜質(zhì)的小麥,在沸水中煮至無白心,瀝干水分,攤開晾干至不沾手(水分含量約40%),然后加6 g石膏,混勻,平均分裝至6個罐頭瓶,塑料膜封口,121 ℃滅菌30 min。

待培養(yǎng)基冷卻后,將活化后的姬松茸葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面菌種切成1 cm×1 cm的小塊接種至小麥培養(yǎng)基中(不接種的作為對照),每瓶接入3塊,置于25 ℃下培養(yǎng)。在菌絲長滿后的第5、10、15、20、30 d時分別取出。

1.3 多酚含量的測定

樣品中游離態(tài)多酚與結(jié)合態(tài)多酚類化合物的提取采用文獻[13,3]的方法。

1.3.1 樣品預(yù)處理 發(fā)酵完成后,取出發(fā)酵后的小麥,40 ℃烘箱中干燥12 h,粉碎,過40目篩,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 游離態(tài)多酚的提取 準(zhǔn)確稱取5 g干燥粉碎的樣品,石油醚索氏抽提去脂。以1∶8(g/mL)加入1% HCl-甲醇溶液,于搖床中25 ℃,130 r/min振蕩提取24 h,然后4000 r/min離心8 min,收集上清,殘渣復(fù)提。二次提取完成后,合并上清。測定游離態(tài)多酚的含量。

1.3.3 結(jié)合態(tài)多酚的提取 將游離態(tài)多酚提取后所得的殘渣,40 ℃烘干后稱重。加入20 mL 2 mol/L NaOH,置于搖床中于25 ℃,130 r/min振蕩1 h進行消化處理,然后用濃HCl將其pH調(diào)至2,加入10 mL乙酸乙酯,靜置10 min后4000 r/min離心8 min,收集乙酸乙酯部分。將收集到的溶液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,甲醇定容至10 mL。測定結(jié)合態(tài)多酚的含量。

1.3.4 多酚含量的測定 多酚含量測定根據(jù)Folin-Cioncalteu比色法[14]。采用沒食子(0～0.1 mg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為:y=7.1671x-0.0035,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。所得多酚含量結(jié)果為干基含量。

1.4 酶活性測定

1.4.1 酶的提取 取1 g的小麥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物,放置于冰預(yù)冷的研缽中,加入5～10 mL蒸餾水,迅速將其研磨成勻漿,然后將勻漿轉(zhuǎn)入離心管中,4 ℃下12000 r/min離心10 min,取上清液作為α-淀粉酶,纖維素酶的提取液。β-葡萄糖苷酶的提取是以pH4.6,0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液作為提取劑,方法同α-淀粉酶,纖維素酶的提取。

1.4.2 纖維素酶酶活性測定 取1 cm×6 cm濾紙條1個置于試管中,加入0.5 mL粗酶液,再加1.5 mL 0.1 mol/L,pH4.4檸檬酸緩沖液,于50 ℃水浴準(zhǔn)確保溫1 h,取出后立即加入1 mL DNS,置于沸水中顯色5 min。迅速冷卻后,加入9 mL蒸餾水,于540 nm處測吸光度值[15]。每小時每克發(fā)酵產(chǎn)物(濕重)水解產(chǎn)生1微摩爾葡萄糖的酶量為1單位。DNS試劑具體制備方法及緩沖液配制方法參照文獻。

1.4.3α-淀粉酶酶活性測定α-淀粉酶酶活性測定參照陳鈞輝等的方法[16]進行。取1%可溶性淀粉溶液0.5 mL(用pH6.9,20 mmol/L磷酸鈉緩沖液配制內(nèi)含6.7 mmol/L NaCl),加入0.5 mL酶的粗提液,25 ℃準(zhǔn)確保溫3 min,立即加入3,5-二硝基水楊酸顯色劑1 mL,于100 ℃水浴沸騰5 min后冷卻,加蒸餾水定容到10 mL,于540 nm處測吸光度值。每小時每克發(fā)酵產(chǎn)物(濕重)水解產(chǎn)生1微摩爾麥芽糖的酶量為1單位。

1.4.4β-葡萄糖苷酶酶活性測定 采用pNPG法測定β-葡萄糖苷酶酶活性[17]。采用對硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)品(0.01～0.1 μmol/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為:y=13.707x-0.0455,相關(guān)系數(shù)R2=0.9773。每小時每克發(fā)酵產(chǎn)物(濕重)水解產(chǎn)生1微摩爾對硝基苯酚的酶量為1單位。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)所得,數(shù)據(jù)圖中用誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel處理并作圖,采用Spss17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對小麥多酚含量的影響

由圖1可知,小麥經(jīng)姬松茸固態(tài)發(fā)酵后,其游離態(tài)多酚含量,結(jié)合態(tài)多酚含量,總酚含量都隨發(fā)酵時間的變化而變化。所測未發(fā)酵小麥提取物中的游離態(tài)多酚含量為1.093 mg/g,結(jié)合態(tài)多酚含量為0.572 mg/g,總酚含量為1.665 mg/g,這與Bhanja等[7]測得的多酚含量結(jié)果一致。之后,隨著發(fā)酵時間的延長,結(jié)合態(tài)多酚的含量逐漸降低,而游離態(tài)多酚的含量逐漸增加,總酚含量在發(fā)酵第5 d時略有降低,之后也隨著發(fā)酵時間的延長而增加。在發(fā)酵時間達到30 d時,小麥提取物的總酚含量和游離態(tài)多酚含量達到最高,分別為3.207 mg/g,3.121 mg/g,為對照的1.926倍和2.855倍。而結(jié)合態(tài)多酚含量在發(fā)酵30 d時最低,為0.087 mg/g,降低了85%。在發(fā)酵過程中,結(jié)合態(tài)多酚含量一直低于游離態(tài)多酚含量。

圖1 姬松茸固態(tài)發(fā)酵后小麥的多酚含量測定結(jié)果Fig.1 The contents of free polyphenols,bound polyphenols and total polyphenols of wheat fermented by Agaricus blazei

圖1的結(jié)果表明,小麥經(jīng)姬松茸發(fā)酵后游離態(tài)多酚和總酚含量顯著提高(p<0.05),而結(jié)合態(tài)多酚隨發(fā)酵時間延長逐漸減少(p<0.05)。結(jié)合態(tài)多酚是谷物中主要的多酚存在形式[18-19],可通過堿、酸或酶處理使其釋放出來。本實驗由于姬松茸在發(fā)酵過程中的代謝活動使得小麥細胞壁分解,使得與蛋白質(zhì)、纖維素、果膠等共價結(jié)合的多酚釋放出來,導(dǎo)致了游離態(tài)多酚和總酚含量的顯著提高。

2.2 發(fā)酵對酶活性的影響

由圖2可知,發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶酶活、α-淀粉酶酶活和β-葡萄糖苷酶酶活均隨發(fā)酵時間的變化而變化。β-葡萄糖苷酶酶活隨著發(fā)酵時間的延長,酶活性增強(p<0.05),且一直低于同水平的纖維素酶和α-淀粉酶的酶活。纖維素酶酶活隨發(fā)酵時間的延長而增加(p<0.05),在發(fā)酵第20 d時達到最大,為150.900 U/g,之后開始降低,在發(fā)酵30 d時酶活為59.502 U/g。同樣,α-淀粉酶酶活也在發(fā)酵第20 d時達到最大,為80.100 U/g。

圖2 姬松茸固態(tài)發(fā)酵后小麥的酶活Fig.2 Enzymes activities of wheat fermented by Agaricus blazei

經(jīng)計算得出姬松茸固態(tài)發(fā)酵后小麥的游離態(tài)多酚含量在0～5 d增長了1.13%,在5～10 d增長了19.15%,在10～15 d增長了50.97%,在15～20 d增長了52.01%,在20～30 d增長了24.42%?？梢钥闯?發(fā)酵時間從0～20 d,游離態(tài)多酚含量的增長量都在增加,而20～30 d增長量降低為24.42%,同纖維素酶活、α-淀粉酶的酶活性變化一致,在酶活性較高時增長量增加,反之,亦然。圖2的結(jié)果表明3種碳水化合物水解酶在姬松茸固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生且隨發(fā)酵時間而變化,α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶作用于小麥釋放多酚,使得游離態(tài)多酚含量增加。據(jù)報道β-葡糖糖苷酶能催化連接在烷基和苯基-β-D-葡萄糖苷之間的糖苷鍵釋放酚苷部分[20]。

3 結(jié)論

姬松茸固態(tài)發(fā)酵能顯著提高小麥的總酚含量和游離態(tài)多含量,最高可達3.207、3.121 mg/g。在發(fā)酵過程中,纖維素酶、α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶降解小麥細胞壁上的化學(xué)成分,導(dǎo)致與細胞壁結(jié)合的多酚酯鍵的水解和木質(zhì)素的氧化降解,從而使結(jié)合態(tài)多酚釋放轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诒蝗梭w吸收利用的游離態(tài)多酚。

然而,發(fā)酵過程并不只是促進結(jié)合態(tài)多酚釋放,還存在若干種多酚代謝途徑,如甲基化、糖基化、去糖基化、硫酸鹽共軛、糖酯化等,這些途徑均可獲得多酚[20-21]。另外,植物中苯丙烷代謝途徑是多酚合成的重要途徑[22-23],發(fā)酵過程是否會對谷物的苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生影響,從而影響多酚含量值得更進一步的研究。

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Effect of solid-state fermentation withAgaricusblazeion polyphenols of wheat

MA Ru-nan,ZHAI Fei-hong,LIU Hong-yan,HAN Jian-rong*

(School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

To investigate the effect of solid state fermentation withAgaricusblazeion polyphenol of wheat and explore the mechanism of polyphenol metabolism,the contents of free polyphenols,bound polyphenols and total polyphenols after solid-state fermentation(SSF)byAgaricusblazeiand the carbohydrates hydrolases enzymes activities of fermented products were determined. As well as the correlations between these enzyme activities and polyphenols contents in fermented products were analyzed. This study indicated that the contents of free and total polyphenols increased with the prolonging of fermentation time. In contrast,the contents of bound polyphenols decreased. The activities of cellulase andα-amylase increased as the time increase initially and decreased afterwards,and reached the maximum at 20 d. The activities ofβ-Glucosidase kept growing in 5～30 days. The carbohydrates hydrolases plays an important role in releasing of bound polyphenols from cell wall.

Agaricusblazei;wheat;polyphenols;carbohydrates hydrolases

2016-08-01

馬茹男(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物資源與生態(tài)，E-mail:15735175948@163.com。

*通訊作者:韓建榮(1959-)，男，博士，教授，研究方向：微生物資源開發(fā)利用，E-mail:hjr@sxu.edu.cn。

TS201.1

A

:1002-0306(2017)03-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.021