成西俠 白建萍 李 靜 張 靜

(西安第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科實驗室，陜西 西安 710032)

濕化法和非濕化法培養(yǎng)新生兔子的原代成骨細胞效果觀察

成西俠 白建萍 李 靜 張 靜

(西安第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科實驗室，陜西 西安 710032)

目的探討濕化法和非濕化法培養(yǎng)新生兔子的原代成骨細胞效果。方法選擇出生1～3天新西蘭白兔20只，取新生兔顱骨1mm2的骨塊，進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶術(shù)前1h A組經(jīng)過血清濕化法處理，B組為經(jīng)過非血清濕化法處理。結(jié)果培養(yǎng)72h后，骨塊周圍細胞長出，培養(yǎng)7天后骨塊周圍具有大量細胞長出，形狀較為規(guī)則，并且細胞貼壁生長；培養(yǎng)10天進行換液傳代。傳代后觀察A組細胞平均貼壁時間明顯低于B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；傳代時A組消化時間與B組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論經(jīng)過組織貼壁法培養(yǎng)細胞，并且經(jīng)過血清濕化法處理培養(yǎng)瓶，細胞的貼壁效果更加顯著。

原代成骨細胞；濕化法；非濕化

成骨細胞的培養(yǎng)在實驗研究中至關(guān)重要，如何有效并且花費較少來培養(yǎng)細胞也是研究的重點，原代細胞培養(yǎng)也是大量成骨細胞產(chǎn)生重要手段。本文收取胚胎兔子的原代成骨細胞通過濕化法和非濕化，觀察兩組培養(yǎng)效果。

1 動物與試劑

1.1 動物分組 選擇出生1～3天，體重為0.2kg的新西蘭白兔20只，對白兔標(biāo)號后按照隨機數(shù)字表法分為A組和B組，每組10只。

1.2 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液(Hycoloe，美國)，100ml青霉素和鏈霉素(1:4)抗體(需要分裝)，胰蛋白酶(南京建成)、胎牛血清(四季青)，L-抗壞血酸50mg等。

1.3 原代成骨細胞提取與培養(yǎng) 取新生1～3天乳兔20只，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡消毒5 min，超凈臺內(nèi)無菌取出兔顱蓋骨，放入含青霉素、鏈霉素0.01 mol/L PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科解剖器械仔細清除骨膜、血管、結(jié)締組織及透明軟骨，無菌冷PBS液沖洗顱蓋骨3次。將顱蓋骨剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的骨塊，加入盛有0.25%胰酶的培養(yǎng)皿中，，放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)30分鐘。棄掉液體，用無菌PBS水沖洗3次。然后將碎骨塊均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶(術(shù)前1 h瓶底涂一層胎牛血清，放入孵箱備用)，骨塊間距為1.0～2.0 mm，使培養(yǎng)瓶瓶底向上置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 h后待碎骨塊牢固貼附時將瓶底翻轉(zhuǎn)向下，小心加入5 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清成骨細胞培養(yǎng)液(DMEM-LG培養(yǎng)基+1 0%胎牛血清)以后每隔48h換液，顯微鏡觀察細胞長滿培養(yǎng)瓶底后，取出骨塊，并且PBS洗滌3次，后續(xù)進行正常的細胞培養(yǎng)、傳代等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行分析處理，P<0.05為表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察及胰酶消化時間比較 原代細胞培養(yǎng)72h后，骨塊周圍細胞長出，培養(yǎng)7天后骨塊周圍具有大量細胞長出，初試為短梭狀，胞體小，隨著培養(yǎng)時間延長胞體逐漸增大，變?yōu)樗笮?，三角形或者多邊形，形狀較為規(guī)則，并且細胞貼壁生長；大概培養(yǎng)10天時細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶，細胞具有漂浮的趨勢，接著進行換液傳代。傳代后觀察A組細胞大約2.0～5.0h，平均(3.8±1.2)h貼壁，B組細胞大約4.0～8.0h，平均(5.8±1.3)h，貼壁差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.532,P=0.037)；傳代時A組消化時間為0.8～2.0min，平均為(1.3±0.8)min，B組為1.0～3.0min，平均(2.2±0.6)min，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.231，P=0.098)。

2.2 透射電鏡觀察 細胞傳代5代后經(jīng)離心沉淀法透射鏡觀察，兩組細胞胞漿均較多，富含線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及分泌小泡等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，有細胞凸起，胞核清晰，具有成骨細胞典型的超微結(jié)構(gòu)特征。

3 討論

成骨細胞培養(yǎng)技術(shù)在臨床已經(jīng)比較成熟，但是對于培養(yǎng)技術(shù)中某個步驟，臨床上應(yīng)用不同[1],比如本文研究的濕化法和非濕化法處理培養(yǎng)瓶對于細胞培養(yǎng)的有什么影響還是不得而知。成骨細胞是一種貼壁細胞，因此貼壁狀態(tài)是否良好，直接影響細胞狀態(tài)，細胞存活率等，對細胞后續(xù)研究真實性或者有效性至關(guān)重要[2]。本文研究發(fā)現(xiàn)新生1～3天兔子原代培養(yǎng)過程經(jīng)過血清濕化法處理的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞貼壁時間縮短，且胰酶消化時間與是否濕化無差異，說明培養(yǎng)瓶濕化法處理培養(yǎng)瓶后，細胞更加容易貼壁，并且細胞狀態(tài)良好。

綜上所述，經(jīng)過組織貼壁法培養(yǎng)細胞，并且經(jīng)過血清濕化法處理培養(yǎng)瓶，細胞的貼壁效果更加顯著。

[1] 楊森, 馮付明, 王銀輝. 乳兔成骨細胞原代培養(yǎng)與鑒定:改良膠原酶與胰酶的分段消化[J]. 中國組織工程研究, 2014，(38):6129-6135.

[2]劉小榮, 張笠, 王勇平,等. 新西蘭乳兔成骨細胞分離、培養(yǎng)與鑒定的實驗研究[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2014，(9):1095-1097.

10.3969/j.issn.2095-9559.2017.05.069

2095—9559(2017)05—3431—01