孫新剛，侯亞芝，馬乾，王荔，王改青，胡為民

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

血管內(nèi)穿刺法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷模型〔1〕

孫新剛1*，侯亞芝2，馬乾2，王荔1，王改青1，胡為民1

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001)

目的：建立一種微創(chuàng)、有效、重復(fù)性好的大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)動(dòng)物模型。方法：制備正常對(duì)照組和SAH組大鼠，每組12 只。采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH后EBI動(dòng)物模型，觀察各組動(dòng)物腦組織大體標(biāo)本，比較各組大鼠一般情況、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦含水量及血腦屏障通透性。結(jié)果：與對(duì)照組及假手術(shù)組相比，SAH組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(t=12.37，P<0.01)，蛛網(wǎng)膜下腔可見彌漫性分布的血液或血凝塊，腦含水量(t=-9.04，P<0.01)及血腦屏障通透性(t=-38.70，P<0.01)明顯增加。結(jié)論：采用血管內(nèi)穿刺法可成功建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷模型。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；早期腦損傷；血管內(nèi)穿刺

研究表明，早期腦損傷(EBI)是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)患者預(yù)后不佳的主要原因[1]。本研究擬采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH后EBI動(dòng)物模型，旨在為有關(guān)EBI的實(shí)驗(yàn)研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24 只，體重300～350 g。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，濕度40%～70%，溫度20～25 ℃，自由攝食飲水，24 h晝夜循環(huán)光照。隨機(jī)分為對(duì)照組及SAH組，每組12 只，其中6 只用于血腦屏障通透性檢測(cè)，另6 只用于腦含水量檢測(cè)。

1.2 動(dòng)物模型制作

采用血管內(nèi)穿刺法制作SAH組動(dòng)物模型[2]。動(dòng)物經(jīng)麻醉、備皮、消毒后，取頸正中切口，分離暴露右側(cè)頸外動(dòng)脈(EGA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎并切斷ECA和ICA之間吻合支，將ECA結(jié)扎切斷拉直，使其與ICA成一直線。取頭部銳化3-0單股尼龍線由頸外動(dòng)脈置入頸內(nèi)動(dòng)脈，深約18.5 mm，有阻力時(shí)再進(jìn)3 mm刺破血管，約15 s后拔出尼龍線，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，恢復(fù)血流并縫合切口。對(duì)照組大鼠采用相同手術(shù)過程，但不穿破血管壁。所有動(dòng)物于術(shù)后24 h處死。

1.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估

參照Garcia等的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分方法[3]，所有大鼠處死前行神經(jīng)功能評(píng)分。共包括6 項(xiàng)：四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性，攀爬運(yùn)動(dòng)，自主運(yùn)動(dòng)，前爪伸展性，觸須反應(yīng)及肢體本體感覺，得分越低神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

1.4 血腦屏障通透性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)方法[4]制作EB標(biāo)準(zhǔn)曲線。大鼠心臟灌注前1 h經(jīng)股靜脈注射2% EB生理鹽水溶液(5 mL/kg)，取適量穿刺側(cè)顳葉基底部腦組織置入盛有50%三氯乙酸溶液1.5 mL的勻漿器中，勻漿離心后取上清液加入3 倍量無水乙醇，計(jì)算每毫升液體所代表的腦組織量。標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)為空白對(duì)照，應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)各組溶液OD值，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析樣本腦組織中的EB含量(ng/mg)，以此為指標(biāo)反映血腦屏障通透性。

1.5 腦含水量檢測(cè)

參照文獻(xiàn)方法采用干濕重法[5]，大鼠斷頭取腦后稱取濕重，然后放入105 ℃電熱干烘箱24 h后再稱干重。根據(jù)如下公式計(jì)算：腦含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

SAH組大鼠麻醉清醒后均出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、乏力，飲水、進(jìn)食及活動(dòng)減少，對(duì)照組未見明顯異常。SAH組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較對(duì)照組明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 大體標(biāo)本觀察

SAH組在蛛網(wǎng)膜下腔可見彌漫性分布的血液或血凝塊，主要分布于顱底蛛網(wǎng)膜下腔，腦組織水腫明顯，未見腦組織損傷(見圖1)。對(duì)照組無蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦水腫(見圖2)。

2.3 血腦屏障通透性及腦含水量檢測(cè)

與對(duì)照組相比，SAH組大鼠血腦屏障通透性及腦含水量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與血腦屏障通透性及腦含水量比較

3 討 論

SAH是一種神經(jīng)系統(tǒng)急危重癥，具有高死亡率及高致殘率的特點(diǎn)[6]。近年來越來越多的證據(jù)表明，導(dǎo)致SAH患者預(yù)后不佳的主要原因是EBI[1]。為明確SAH后EBI的發(fā)病機(jī)制，急需制備一種能模擬其病理生理變化的動(dòng)物模型。以往有關(guān)SAH的實(shí)驗(yàn)研究，多采用蛛網(wǎng)膜下腔注血法制備動(dòng)物模型，以枕大池注血法最常見[7]。該方法所致出血組織的分布部位與后循環(huán)動(dòng)脈瘤破裂所致出血相近，但臨床上約90%的SAH患者其動(dòng)脈瘤性位于前循環(huán)[8]。本研究采用血管內(nèi)穿刺法刺破前循環(huán)的血管，顱腔保持閉合，能更好地模仿人類動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理過程。

圖1 SAH組大鼠腦標(biāo)本觀察

圖2 對(duì)照組大鼠腦標(biāo)本觀察

EBI是指SAH后72 h內(nèi)全腦組織所發(fā)生的直接損傷，包括血腦屏障破壞、腦水腫及腦細(xì)胞凋亡等[9]。本研究中SAH組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯減低，腦組織含水量及血腦屏障通透性明顯增加，說明此模型可成功模擬SAH后EBI的病理改變過程。本方法操作簡(jiǎn)單，易重復(fù)，為SAH后EBI發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]LANTIGUA H，ORTEGA-GUTIERREZ S，SCHMIDT J M，et al.Subarachnoid hemorrhage：who dies，and why？[J].Crit Care，2015，19(1)：309.

[2]BEDERSON J B，GERMANO I M，GUARINO L.Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat[J].Stroke，1995，26(6)：1 086-1 091.

[3]李翠萍，錢素云.降鈣素原在危重癥監(jiān)護(hù)中的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，2004，31(2)：84-86.

[4]BELAYEV L，SAUL I，BUSTO R，et al.Albumin treatment reduces neurological deficit and protects blood-brain barrier integrity after acute intracortical hematoma in the rat[J].Stroke，2005，36(2)：326-331.

[5]XI G，HUA Y，BHASIN R R，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of extravasated red blood cells on blood flow and blood-brain barrier integrity[J].Stroke，2001，32(12)：2 932-2 398.

[6]MACDONALD R L.Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage[J].Nat Rev Neurol，2013，10(1)：44-58.

[7]VATTER H，WEIDAUER S，KONCZALLA J，et al.Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage：clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model[J].Neurosurgery，2006，58(6)：1 190-1 197.

[8]VELTHUIS B K，RINKEL G J，RAMOS L M，et al.Subarachnoid hemorrhage：aneurysm detection and preoperative evaluation with CT angiography[J].Radiology，1998，208(2)：423-430.

[9]FUJII M，YAN J，ROLLAND W B，et al.Early brain injury，an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research[J].Transl Stroke Res，2013，4(4)：432-446.

A model of early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage established by intravascular puncture

SUN Xingang1，HOU Yazhi2，MA Qian2，WANG Li1，WANG Gaiqing1，HU Weimin1

(1.The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To establish a model of early brain injury (EBI) following experimental subarachnoid hemorrhage (SAH) in rat.Methods：A total of 24 healthy SD rats were randomly divided into either SAH (n=12) or control group (n=12).Intravascular puncture method was adopted to establish the EBI animals after SAH model.The general condition，neurobehavioral scores，cerebral water content and permeability of blood brain barrier of the two groups were compared.Results：Blood spread the subarachnoid space of rats in the SAH group.Compared with that of the control group，the neurobehavioral scores of the SAH group decreased significantly (t=12.37，P<0.01)，while the cerebral water content (t=-9.04，P<0.01) and permeability of blood brain barrier (t=-38.70，P<0.01) increased significantly.Conclusion：Intravascular puncture makes a reliable model of early brain injury following experimental SAH rat.

subarachnoid hemorrhage；early brain injury；intravascular puncture

1671-8631(2017)03-0211-03

〔1〕本課題為山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院博士基金課題(項(xiàng)目編號(hào)：201501-7)

*本文通訊作者：孫新剛

R651.1

A

2016-12-30

(本文編輯：張紅)

孫新剛(1982— )，男，山西省運(yùn)城市人，博士學(xué)位，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病的臨床與基礎(chǔ)研究工作。