潘金春，羅銀珠，吳瑞可，王靜，袁文，何麗芳， 黃碧洪，張鈺*

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663；2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

小鼠感染細小病毒的臨床特征分析

潘金春1,2，羅銀珠1,2，吳瑞可1,2，王靜1,2，袁文1,2，何麗芳1,2， 黃碧洪1,2，張鈺1,2*

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663；2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的 分析小鼠細小病毒(MVM)在人工感染小鼠體內(nèi)的分布規(guī)律、排毒和抗體變化，以及自然條件下小鼠感染MVM的情況。方法 對33只BALB/c小鼠腹腔接種0.2 mL MVM懸浮液，每天觀察動物的外觀、行為、飲食和精神狀態(tài)，在接種第0～60 天共12個時間點各對2～3只動物進行安樂死，并采取組織、糞便和血清樣本進行檢測。熒光定量PCR(QPCR)方法檢測組織和糞便的病毒核酸，ELISA方法檢測血清抗體。同時，采取100只SPF小鼠、76只開放飼養(yǎng)小鼠檢測MVM核酸，采取1463只SPF小鼠、82只開放飼養(yǎng)小鼠檢測MVM抗體。結(jié)果 實驗小鼠接種MVM后外觀、行為、飲食和精神狀態(tài)未見異常，剖檢無明顯病變。各組織在接種后都能檢出病毒核酸，并在接種后4～7 d達到峰值，且到60 d仍可檢出病毒核酸。各組織間比較，病毒峰值最高的組織是肝，其次是腎、脾、胃、心臟、肺、盲腸和腦。糞便排毒在接種后11 d可達到峰值，之后迅速下降，但到60 d還可檢到。血清抗體在病毒接種后7 d開始產(chǎn)生，之后抗體效價逐漸升高，21 d就可以達到32倍左右，之后至60 d一直處于64倍左右。臨床樣本中，核酸檢測SPF小鼠未檢出，開放飼養(yǎng)小鼠的檢測陽性率為14.5%，經(jīng)過測序比較確認為MVM病毒感染；抗體檢測SPF小鼠有較低的檢出率(0.3%)，開放飼養(yǎng)小鼠檢出率為68.3%。結(jié)論 MVM感染小鼠后一般呈隱性感染狀態(tài)，可長期排毒，主要組織臟器、糞便、血清都能用于MVM的檢測，實驗小鼠感染MVM可以通過病毒核酸和血清抗體檢測方法進行病原檢測。

小鼠細小病毒；人工感染；自然感染；臨床特征

細小病毒按其是否能夠自主增殖分為腺聯(lián)病毒和自主性細小病毒，其中小鼠細小病毒(minute virus of mice，MVM)就是一種自主性細小病毒，最初由Crawford從被污染的小鼠腺病毒種毒中首次分離[1]，后來又相繼從實驗小鼠和野生小鼠從分離到該病毒。MVM在世界范圍內(nèi)廣泛存在，歐洲、美國、加拿大和澳大利亞等國家和地區(qū)都有相當(dāng)高的感染率，中國1990年證實在普通小鼠群MVM感染也相當(dāng)普遍[2]。

MVM在自然條件下常常呈隱性感染，臨床上不表現(xiàn)任何癥狀[3]。在實驗室條件下，MVM可感染小鼠、大鼠和倉鼠，小鼠和大鼠一般無臨床癥狀，而倉鼠則可導(dǎo)致致死性感染[4]。MVM感染小鼠后帶毒時間長，病毒在體內(nèi)廣泛分布，成為多個細胞系、白血病和可移植腫瘤的常見污染物[5]，并可在細胞系中形成持續(xù)性感染，可能會嚴重影響細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的試驗結(jié)果。

為驗證在自然感染和人工接種條件下MVM在小鼠體內(nèi)的抗原和抗體變化情況，本研究通過腹腔接種MVM的方式感染實驗小鼠，對小鼠體內(nèi)病毒分布、排毒和抗體產(chǎn)生進行研究，并結(jié)合對小鼠臨床樣本感染MVM的檢測，為該病原檢測技術(shù)方法的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細胞株

MVM標準株和A9細胞株購自美國典型菌種保藏中心(毒株：ATCC VR-1346；細胞株：ATCC? CCL1.4TM)。復(fù)蘇A9細胞，10%胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)3～5 d，待細胞長至單層，傳代分瓶，分瓶后待細胞長至80%～90%密度，棄去生長液，加入500 μL MVM病毒液于75 cm2細胞瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附l h，棄去瓶中的病毒液加入無血清的DMEM細胞維持液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，當(dāng)細胞病變達“+++—++++”時，收獲細胞培養(yǎng)病毒液，-80℃凍存，反復(fù)凍融三次后，3500 r/m離心30 min去除細胞碎片，留上清即為收獲的MVM病毒裂解液，傳代三次，收獲的病毒裂解上清液用QPCR對病毒拷貝數(shù)進行定量。

1.1.2 實驗動物

35只SPF級BALB/c小鼠，雄性，3周齡，體重11～13 g，購自于廣東省實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0002]，飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所二級生物安全感染實驗室內(nèi)[SYXK(粵)2012-0122]，實行光照/黑暗各12 h晝夜循環(huán)，自由進食及飲水。

1.1.3 臨床樣本

核酸檢測臨床樣品包括SPF小鼠和開放飼養(yǎng)小鼠，SPF小鼠來源于2010～2014年本實驗室收到廣東、湖北、北京、四川、云南和上海等各省市送檢的SPF級活體小鼠或小鼠糞便100份；開放飼養(yǎng)小鼠為從廣州周邊地區(qū)收集的76只KM小鼠和褐家鼠。

抗體檢測臨床樣品包括成年SPF小鼠和開放飼養(yǎng)小鼠，SPF小鼠為2013～2015年之間廣東省檢測的1463只SPF小鼠，包括BALB/c、C57BL/6、KM、ICR、BALB/c-nu、NIH、129、C3H等常規(guī)品系以及多種基因工程小鼠；開放飼養(yǎng)小鼠為從廣州周邊地區(qū)收集的兩批共82只開放飼養(yǎng)的KM小鼠。

1.1.4 主要試劑和儀器

DNA聚合酶購自大連寶生物公司，DNA抽提試劑盒購自天根公司(TIANamp Genomic DNA Kit)，QPCR試劑盒購自Takara(Taqman PCR試劑盒)，ELISA抗體檢測試劑盒購于Express Bio公司，DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司，其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀為ABI的7500，酶標儀為Thermo的Multiskan GO。

1.1.5 引物

所用MVM QPCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，上游序列為：5’- GCCATACACACCTGCAGCAAA -3’；下游序列為：5’- TGGYGATGCTATGGTTGGT -3’；探針為：5’- FAM- TCAATGGAAACACTTGGTTTCTACCCTTGGA -BHQ-1-3’。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種、觀察及取材

實驗小鼠禁食不禁水過夜，共33只小鼠每只小鼠腹腔注射病毒懸浮液0.2 mL(病毒含量為1.2×107copies/μL)。動物接種病毒后，連續(xù)觀察60 d，每天觀察動物的外觀、行為活動、飲食和精神狀態(tài)等。并在感染前第0天取2只動物，感染后第4、7、11、14、18、21、32、35、46、54、60 天時，隨機各取3只動物，每只小鼠腹腔注射0.1 mL 0.1%戊巴比妥鈉麻醉，然后摘眼球采血并制備血清，分別置-20℃待測抗體效價。動物脫頸椎安樂死后快速取出心臟、肝、脾、肺、腎、腦、胃和盲腸等置-20℃待測病毒核酸。同時采取糞便樣本，置-20 ℃待測病毒核酸。

臨床樣本中核酸檢測樣品無菌采集活體小鼠的盲腸內(nèi)容物或直接采集糞便，分別置-20℃待檢病毒核酸；抗體檢測樣品則將小鼠麻醉后摘眼球采血并分離血清，分別置-20℃待檢抗體。

1.2.2 病毒核酸檢測(QPCR)

每個組織和糞便樣本取0.2 g，加入600 μL的PBS緩沖液及加入適量氧化鋯研磨珠，于研磨機上研磨3～5 min，將組織勻漿。研磨后，10 000 r/min離心10 min，取200 μL上清按試劑盒說明抽提核酸及QPCR檢測。本QPCR檢測的靈敏度為100拷貝，大于100拷貝的檢測結(jié)果判為陽性；小于100拷貝則判為陰性。

1.2.3 血清抗體檢測(ELISA)

試驗開始前將試劑盒在室溫平衡30 min左右，先將血清樣本倍比稀釋(臨床樣本不稀釋，只檢陰陽性)，再按試劑盒說明進行操作。將檢測結(jié)果為陽性的最高血清稀釋倍數(shù)作為樣本的抗體效價/稀釋度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

實驗結(jié)束，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prim 5軟件進行處理及分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

BALB/c小鼠接種MVM后，外觀、行為、飲食和精神狀態(tài)等都無明顯變化，無明顯病理學(xué)變化，總體呈現(xiàn)隱性感染狀態(tài)。

2.2 病毒核酸檢測結(jié)果

2.2.1 組織

由圖1可知，小鼠接種病毒后各組織臟器均可檢測到病毒，除接種后18 d腦和盲腸低于100拷貝外，其他各組織各時間點的病毒拷貝數(shù)都在100以上。各組織臟器的病毒載量都在4～7 d達到峰值，之后病毒載量總體呈下降趨勢，但還有所波動，肝和脾在接種后32～35 d仍可達到較高水平(2×104copies/μL左右)，其他組織臟器已經(jīng)降到1000 copies/μL左右。到接種后60 d各組織臟器還可以檢測到病毒，但其拷貝數(shù)相對峰值已經(jīng)較低(300 copies/μL左右)。各組織器官之間橫向比較(圖2)，病毒載量峰值最高的是肝(1.10×105copies/μL)，之后依次是腎(4.13×104copies/μL)、脾(2.63×104copies/μL)、胃(2.14×104copies/μL)、心臟(1.23×104copies/μL)、肺(1.09×104copies/μL)、盲腸(5.02×103copies/μL)、腦(1.73×103copies/μL)。

2.2.2 糞便

小鼠接種病毒后很快可以從糞便排毒，在第11天糞便排毒可以達到峰值(1.37×104copies/μL)，之后病毒載量迅速下降，并呈現(xiàn)300 copies/μL到3806 copies/μL的波動，到接種后60 d排毒量降到398 copies/μL(圖3)。

2.3 血清抗體變化

2.3.1 實驗動物

小鼠接種MVM后7 d就開始產(chǎn)生抗體，之后抗體效價逐漸升高，21 d抗體稀釋度就可以達到32倍左右，之后至60 d抗體稀釋度一直處于64倍左右的水平，為便于計算，抗體稀釋度用2的指數(shù)表示(圖4)。

2.4 小鼠MVM臨床樣本檢測

2.4.1 核酸檢測

SPF小鼠未檢測到MVM核酸，而開放飼養(yǎng)小鼠的檢測陽性率為14.5%，具體結(jié)果見表1。對其中三份陽性樣本進行測序驗證，測序結(jié)果顯示三個樣本擴增的基因序列相同，均為73 bp(圖5)。通過Genebank上的Blast軟件進行序列比對，陽性樣本的序列與Genebank上的MVM毒株(登錄號J02275)的同源性為100%，證明臨床樣本為MVM陽性樣本。

圖1 各組織病毒載量(n =3)Fig.1 Viral loads of MVM in the mouse organs and tissues

注：A～H分別為：心臟、肝、脾、肺、腎、胃、腦、盲腸。圖2 各組織病毒載量峰值(n=3)Note. A-H: Heart, liver, spleen, lung, kindey, stomach, brain, cecum.Fig.2 Viral peak loads of MVM in organs and tissues

圖3 糞便病毒載量(n =3)Fig.3 Viral load of MVM in the mouse feces

表1 小鼠MVM核酸陽性檢出率統(tǒng)計

2.4.2 抗體檢測

由表3可知，SPF小鼠有較低的抗體檢測陽性率(0.3%)，而開放飼養(yǎng)小鼠則有很高的檢出率(68.3%)。

圖4 接種MVM后BALB/c小鼠的血清抗體效價測定(n =3)Fig.4 Determination of serum antibody against MVM in the BALB/c mice after inoculation

樣本類型動物數(shù)(N)Number陽性動物數(shù)Positivenumber陽性率/%PositiverateSPF小鼠SPFmice146340 3%開放飼養(yǎng)小鼠Miceinopenhousing825668 3

3 討論

MVM是一種單鏈DNA病毒，其具有高度傳染性、廣泛存在于實驗鼠和野生鼠群中。MVM可感染多種組織和細胞，尤其傾向于感染和殺死腫瘤細胞[6]。MVM感染小鼠后，可激活機體的免疫系統(tǒng)，尤其是T、B淋巴細胞的活性，因而可增強動物自發(fā)性和誘發(fā)性腫瘤的能力，并可抑制小鼠移植瘤的生長[7-8]。因此在使用小鼠從事腫瘤學(xué)方面的研究時，應(yīng)特別注意排除MVM，否則將會嚴重地影響試驗結(jié)果[5]。

圖5 陽性樣本測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of positive samples

本研究證實，BALB/c小鼠在感染MVM后呈隱性感染，臨床上并未表現(xiàn)明顯癥狀和病理變化，與文獻報道一致[3、5]。動物心臟、肝、脾、肺、腎、腦、胃和盲腸等組織臟器很快就能檢出病毒載量，接種后4～7 d達到峰值，之后病毒載量呈下降趨勢，但至60 d還可以檢出病毒核酸，說明MVM可侵襲小鼠的多個組織臟器，且能長時間帶毒。在感染前期(5周內(nèi))，肝、腎、脾的病毒載量較高，尤其是肝、脾可以維持較長時間的高病毒載量，適合于病毒核酸檢測；到感染后期，各組織臟器的病毒載量都已下降到較低水平，但仍可用于病毒核酸檢測。

小鼠接種MVM后很快就可以從糞便排毒，排毒量在第11天能達到峰值，相比組織峰值時間的4～7 d有所延遲。之后病毒載量呈下降趨勢，但一直到60 d能可檢出病毒核酸。說明小鼠感染MVM后可長期向外排毒，因此感染小鼠的糞便也可用于病毒核酸檢測。小鼠接種MVM后7 d就可以檢測到抗體，之后抗體逐漸升高，并一直到60 d都可以維持較高的抗體水平，說明血清MVM抗體檢測也是一種有效的檢測方法。

臨床樣品中，SPF小鼠的核酸檢測率為0，而抗體有較低的檢出率(0.3%)，與之相比，開放飼養(yǎng)的小鼠核酸和抗體檢出率分別為14.5%和68.3%。相關(guān)報道也說明臨床上小鼠MVM有一定的檢出率，隋麗華等檢測了390只SPF小鼠，MVM抗體陽性率為0.52%[9]；上海2010～2014年期間小鼠監(jiān)督和委托檢測數(shù)據(jù)顯示MVM的抗體陽性率在0.1%～0.2%之間[10]；鞏薇用PCR法檢測小鼠自身攜帶的細小病毒，MVM陽性率為16%[11]。王淑菁等建立了MVM熒光定量PCR的檢測方法[12]，具有特異、靈敏的優(yōu)點。因此，這兩種檢測方法在臨床上可以得到很好的應(yīng)用。

本研究發(fā)現(xiàn)MVM感染小鼠后在動物體內(nèi)的分布、排毒及血清抗體產(chǎn)生規(guī)律，并將核酸檢測和抗體檢測在臨床樣品檢測中進行應(yīng)用，說明感染小鼠的主要組織臟器、糞便、血清都能用于MVM的檢測，同時病毒核酸載量、抗體水平與感染階段密切相關(guān)。

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Analysis of the clinical features of mice with minute virus infection

PAN Jin-chun1,2, LUO Yin-zhu1,2, WU Rui-ke1,2, WANG Jing1,2, YUAN Wen1,2, HE Li-fang1,2, HUANG Bi-hong1,2, ZHANG Yu1,2*

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663, China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663)

Objective To analyze the tissue distribution, viral excretion and serological antibody in BALB/c mice artificially infected with minute virus of mice (MVM), and the natural infection status in mice. Methods Thirty-three SPF male 3-week old BALB/c mice were intraperitoneally injected with 0.2 mL of MVM in 1.2×107copies/μL concentration. The general status of the animals was observed daily post inoculation. The animals’ tissue,faeces and serum samples were taken at 12 time points before and after inoculation (2-3 animals at each time point). QPCR method was used to detect the viral nucleic acid in tissues and feces, and the serological antibody against MVM was tested by ELISA. Meanwhile,other clinical samples of 1563 SPF mice and 158 mice in open housing were collected for testing the viral nucleic acid and antibody. Result There were no clinical symptoms and pathological changes among all infected mice. The viral loads of each tissue reached the peak at 4 d or 7 d post inoculation, and then were generally on a declining curve, but were still found at 60 d. Comparing the viral load in tissues showed that the highest tissue was liver, followed by kidney, spleen, stomach, heart, lung, cecum and brain. The viral loads in feces reached the peak at 11 d, and then dropped rapidly, but could be still detected at 60 d. The antibody could be detected at 7 d, and then gradually raised. The antibody dilution degrees reached 32 at 21 d, and maintained high levels with 16 to 128 during 32 d to 60 d. In the clinical samples, the nucleic acid tests were negative in SPF mice, however, a positive rate of 14.5% was found in mice in open housing. Meanwhile, the antibodies of MVM showed a low positive rate in SPF mice, and the positive rate was 68.3% in the mice in open housing. Conclusions The mice generally present occult infection after inoculation of MVM. However, the infected mice can shed virus in a long period, and viral loads of tissues and serological antibody can be maintained for a long time. Thus, MVM can be detected by testing viral nucleic acid and serological antibody.

Minute virus of mice; Artificial infection; Natural infection; Clinical features

ZHANG Yu，E-mail: zhangyugzh@hotmail.com

廣東省科技計劃項目(2014B070706006，2013B060400028，2014A070705003)。

潘金春(1979-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：實驗動物質(zhì)量監(jiān)測和比較醫(yī)學(xué)研究。Email：jcpan@sina.com

張鈺(1970-)，女，研究員。E-mail: zhangyugzh@hotmail.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0064-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.012

2016-07-22