狄曉鴻，常子倩，馬 萍*

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.火箭軍總醫(yī)院，北京 100088）

基于色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)在卵巢癌研究中的應(yīng)用

狄曉鴻1，常子倩2，馬 萍2*

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.火箭軍總醫(yī)院，北京 100088）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，致死率居婦科惡性腫瘤首位。代謝組學(xué)是近年發(fā)展起來的對某一生物或細胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析的新學(xué)科。人體任何的生理或病理改變都可由代謝表型反映，因此，卵巢癌發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出的代謝變化規(guī)律必然可由代謝組學(xué)研究測定，以獲得系統(tǒng)性、整體性、動態(tài)性信息，為卵巢癌早期診斷、合理治療提供理論依據(jù)。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展極大地影響了代謝組學(xué)研究，目前已成為廣泛應(yīng)用且功能強大的分析工具。本文綜述近幾年有關(guān)色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在卵巢癌代謝組學(xué)中應(yīng)用的研究成果。

代謝組學(xué)；色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；卵巢癌

1 代謝組學(xué)與醫(yī)學(xué)研究

代謝組學(xué)是近年來在系統(tǒng)生物學(xué)蓬勃發(fā)展背景下出現(xiàn)的一門新興學(xué)科，主要是利用高通量的化學(xué)分析技術(shù)及化學(xué)計量方法，對生物體內(nèi)不同的病理、生理或生長狀況下的代謝組進行動態(tài)分析，通過反映整體的代謝指紋圖譜監(jiān)測體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的運行狀態(tài)、診斷疾病、評價療效、預(yù)測人體健康發(fā)展趨勢。代謝組用于表示代謝物整體，即一個細胞、組織或器官中所有代謝物組分的集合，包括生化反應(yīng)的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物，主要是一些相對分子質(zhì)量為800～1 000×103的不同化學(xué)類型的小分子物質(zhì)[1，2]。

機體的正常生理活動依賴于循環(huán)、泌尿等系統(tǒng)的平衡發(fā)展，當(dāng)這種平衡因外源性或內(nèi)源性因素發(fā)生改變時，就會出現(xiàn)代謝水平紊亂，若紊亂達到一定程度，就會出現(xiàn)細胞乃至組織水平的宏觀變異，最終發(fā)生病理性改變。體內(nèi)發(fā)生的代謝紊亂往往會在尿液和血液等體液代謝組中體現(xiàn)，因此，對尿液和血液等體液的代謝組進行檢測分析，就有可能對疾病發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的生物化學(xué)變化進行了解與認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病的早期代謝組標(biāo)志物，認(rèn)識其分子機理[3]。因此，代謝組學(xué)在腫瘤相關(guān)研究方面日益凸顯出無法比擬的優(yōu)勢。

2 代謝組學(xué)研究方法與色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

代謝組學(xué)研究主要包括以下幾個步驟：樣本收集與制備，樣本檢測與數(shù)據(jù)獲得和處理，生物統(tǒng)計學(xué)分析與數(shù)據(jù)闡釋。

代謝組學(xué)研究最先且最關(guān)鍵的步驟是樣本的收集、儲存和預(yù)處理。血液及其衍生物和尿液因容易獲得極大的量成為研究中最常用的樣本，另外，唾液、呼吸濃縮物、支氣管洗滌物、胰液、前列腺液、排泄物和其他類型的生物體液或者替代組織都可以用于代謝組學(xué)研究。對于不同的生物體液，大多數(shù)分析模型的標(biāo)準(zhǔn)樣本量要求為0.1～0.5 ml[4]。

代謝組學(xué)研究的核心技術(shù)是核磁共振技術(shù)（NMR）和質(zhì)譜技術(shù)（MS），現(xiàn)有的分析方法基本歸為3類：磁共振波譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法和色譜/核磁/質(zhì)譜聯(lián)用方法。相對于NMR，MS的優(yōu)勢是具有很高的靈敏度和專屬性，但是MS要求代謝成分預(yù)先分離，這就需要與色譜技術(shù)聯(lián)用，包括氣相色譜（GC）和液相色譜（LC），其中高效液相色譜（HPLC）更常用。NMR可以提供分子結(jié)構(gòu)及化合物濃度的詳細信息，但是其敏感度比MS低，通常需要大量樣本，而且使用NMR檢測的樣本常不經(jīng)過預(yù)先分離，每一個代謝成分的信號均顯示出來，以至于信號復(fù)雜冗長。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展極大地影響了包括代謝組學(xué)在內(nèi)的生物學(xué)研究，已成為廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究且功能強大的分析工具[5，6]。

代謝組學(xué)研究的最后一步是數(shù)據(jù)的分析與闡釋，包括計算及生物信息的處理。為了進行成分識別和定量分析，獲得的MS或NMR數(shù)據(jù)需要進行標(biāo)準(zhǔn)化處理及多變量統(tǒng)計分析。經(jīng)過處理的數(shù)據(jù)能夠被代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫識別，這些數(shù)據(jù)庫有Human Metabolome Database（HMDB）、METLIN、Golmdatabase、MassBank、Hpid Maps等。多變量統(tǒng)計分析方法包括監(jiān)督的和非監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法，監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法如偏最小二乘法——判別分析（PLS-DA）、基于正交信號校正的偏最小方差——判別分析（OPLS-DA）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）、支持向量機（SVM）等通過建立模型來對樣本進行分析，非監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法如主成分分析法（PCA）、層次聚類分析（HCA）、非線性映射（NLM）等將得到的分類信息與數(shù)據(jù)原始信息進行比較，建立代謝產(chǎn)物與原始數(shù)據(jù)的關(guān)系。其中，PCA和PLS-DA是目前代謝組學(xué)研究中普遍使用的多變量統(tǒng)計分析方法[4]。

3 色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在卵巢癌代謝組學(xué)中的應(yīng)用研究

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)腹脹、排便困難等癥狀時往往已屬晚期，缺乏有效的治療手段，因此卵巢癌死亡率居婦科腫瘤首位，且5年生存率低[7]。目前，女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷主要依賴于典型癥狀和篩查試驗，如婦科檢查、經(jīng)陰道超聲檢查及腫瘤標(biāo)記物篩查，這些檢查及腫瘤標(biāo)記物篩查靈敏度都不高且不具有特異性。如臨床上CA125是最常用的生物標(biāo)記物，但其并不在所有的卵巢癌患者尤其是早期患者中高表達，而且CA125在其他腫瘤及婦科良性疾病中也會高表達，對卵巢癌特異性不強。因此，尋找早期診斷卵巢癌的方法或標(biāo)記物，確定腫瘤分型、分期及預(yù)后評估仍然是研究重點。

3.1 在卵巢癌診斷方面的研究

有文獻[8]使用GC-MS、LC-MS聯(lián)合PLS-DA對10例乳腺癌、9例卵巢癌、12例宮頸癌患者和22例正常人的尿液標(biāo)本進行對照檢測。先用非目標(biāo)的定性分析得到樣本的代謝模式，再用目標(biāo)的定量分析對激素代謝物進行檢測。對于卵巢癌，研究發(fā)現(xiàn)3種潛在的生物標(biāo)記物：1-甲基腺苷、3-甲基尿嘧啶核苷、4-雄甾烯-3，17-二酮。這3種代謝物的水平在卵巢癌患者尿液標(biāo)本中顯著升高，并且均與DNA甲基化高度相關(guān)。提示代謝組學(xué)研究不僅可作為疾病診斷和患者分層的工具，還可通過代謝網(wǎng)絡(luò)反映疾病狀態(tài)。

Chen J等[9]分兩步篩選和驗證新的上皮性卵巢癌（EOC）代謝標(biāo)記物。第一步是篩選，該研究使用基于非目標(biāo)代謝組學(xué)的LC-MS技術(shù)，分析了27例正常女性、28例良性卵巢腫瘤患者和29例EOC患者的血清標(biāo)本，通過OPLS-DA分析模型對3組進行區(qū)分，其中27-非-5β-膽甾-3，7，12，24，25-五醇葡糖苷酸（27-nor-5β-cholestane-3，7，12，24，25pentolglucuronide，CPG）、苯丙氨酸、甘氨膽酸、二乙酮肉堿、苯丙氨酸-苯丙氨酸二肽和聚碳酸酯6種代謝物被挑選出來作為潛在的待選生物標(biāo)記物。第二步是驗證，對另外685份來自不同臨床背景的血清樣本使用基于目標(biāo)代謝組學(xué)的LC-MS分析。結(jié)果顯示，CPG為潛在的生物標(biāo)記物，在EOC患者血清中的含量高于良性卵巢腫瘤患者（P=0.001），同時，CPG在早期EOC（stage I）和3種組織類型的EOC患者血清中的含量均升高。所以，CPG可作為CA125的補充，即統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的生物標(biāo)記物，用于早期EOC檢查。

武振宇等[10]對37例卵巢癌和51例非卵巢癌患者的尿液樣本應(yīng)用HPLC-MS進行分析，得到23 447個代謝組分，采用分類決策樹作為基礎(chǔ)算法，應(yīng)用Boosting方法建模得到排序靠前的10個差異代謝組分，將卵巢癌患者與對照組患者進行很好的判別分類，其ROC曲線下面積達到0.944。張濤等[11]應(yīng)用超高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-TOF/MS），從卵巢癌及卵巢良性腫瘤患者血漿中分離出535種代謝物，聯(lián)合應(yīng)用PLS-DA進行分析，并通過與數(shù)據(jù)庫對比，篩選出3種代謝物，分別是L-色氨酸、哌啶酮、溶血磷脂酰膽堿。這些代謝物將可能作為新的腫瘤標(biāo)志物，為卵巢癌診斷提供依據(jù)。

Guan W等[12]研究了對卵巢癌及良性卵巢腫瘤患者血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)自動分類的新方法，評價了使用SVM對代謝數(shù)據(jù)進行分類的效果，該數(shù)據(jù)是為了識別潛在代謝性診斷標(biāo)記物的組合，通過HPLC/TOF MS分析37例卵巢癌及35例良性卵巢腫瘤患者的血清標(biāo)本而獲得的。該研究通過評價選定的代謝物組合區(qū)分卵巢癌和良性卵巢腫瘤樣本的能力，使用3種方法對SVM模型進行驗證。綜合的統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗顯示，區(qū)分血清樣本的準(zhǔn)確率達90%，提示該方法可能成為基于代謝組學(xué)的準(zhǔn)確可信的卵巢癌檢查手段。

3.2 在卵巢癌臨床分型分期方面的研究

Denkert等[13]首次應(yīng)用氣相/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（GC-TOF MS）分析了66例侵襲性卵巢癌和9例交界性卵巢腫瘤的代謝物譜，發(fā)現(xiàn)其主要區(qū)別是嘌呤、嘧啶代謝、糖脂以及能量代謝，通過聚類、主成分分析以及分類預(yù)測模型區(qū)分兩種類型腫瘤的準(zhǔn)確率達90%。

郝秀玉[14]利用HPLC-MS及PCA、PLS-DA對56例原發(fā)性上皮性卵巢癌患者尿液進行分析，發(fā)現(xiàn)8種在卵巢癌患者尿液中含量增加并且能夠區(qū)別健康人和不同臨床分期卵巢癌患者代謝狀態(tài)的代謝物，分別是N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸、5-甲硫腺苷、尿酸-3-核苷、假尿嘧啶核苷、L-纈氨酸、琥珀酸、L-脯氨酸及β-煙酰胺單核苷酸。單因素方差分析顯示，這8種潛在的生物標(biāo)記物在健康人和不同臨床分期卵巢癌患者尿液中水平不同，而且隨著病情的發(fā)展，多數(shù)呈現(xiàn)逐漸增高趨勢。其中N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸和假尿嘧啶核苷水平增高趨勢典型并且規(guī)律，不但在健康人和卵巢癌患者尿液中明顯不同，而且在處于不同臨床分期的卵巢癌患者尿液中也存在明顯差異，因而對卵巢癌患者早期診斷及臨床分期可能更具有價值。

3.3 在卵巢癌其他方面的應(yīng)用研究

崔廣波等[15]采用基于GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究人體卵巢癌紫杉醇耐藥細胞A2780/Taxol與敏感細胞之間內(nèi)源性代謝物的差異，初步探討了A2780/Taxol細胞生物學(xué)特性和耐藥機制。研究使用濃度梯度法建立A2780/Taxol細胞，并通過細胞形態(tài)觀察，生長曲線測定，藥物敏感試驗，細胞內(nèi)多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1）、P-糖蛋白（P-gP）和肺耐藥蛋白（LRP）水平測定，評價A2780/Taxol細胞的生物學(xué)特性。同時，采用GC-MS代謝組學(xué)方法分別對卵巢癌敏感細胞株與紫杉醇耐藥細胞株的代謝物指紋圖譜進行分析，并通過PLS-DA對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行多元處理。研究結(jié)果表明，人卵巢癌敏感細胞與耐藥細胞的琥珀酸、天冬氨酸、果糖、肌醇等13種內(nèi)源性代謝物存在顯著性差異，糖降解、三羧酸（TCA）循環(huán)、肌苷代謝途徑發(fā)生了異常改變，而這可能與卵巢癌細胞的耐藥機制有關(guān)。

總之，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個與代謝相關(guān)的過程，通過代謝組學(xué)研究能探索腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中的代謝改變，發(fā)現(xiàn)可用于卵巢癌早期預(yù)警、診斷、評估和預(yù)后的新的標(biāo)記物。

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（*通訊作者：馬萍）

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1671－1246（2017）15－0150－03