劉珍敏 許紅梅

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（重慶 400014）

兒童結(jié)核病診斷技術(shù)新進(jìn)展及展望

劉珍敏 許紅梅

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（重慶 400014）

在發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)核病多發(fā)生在中老年人群中，而在發(fā)展中國(guó)家則多發(fā)生在兒童。據(jù)世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報(bào)告，2014年全球結(jié)核病患者新增960萬(wàn)例，其中兒童結(jié)核病新增100萬(wàn)例[1]。中國(guó)作為全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率均非常高。兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，免疫功能尚未成熟，暴露后更易受到結(jié)核菌感染，且年齡越小，發(fā)病率越高、病情越重。長(zhǎng)久以來，兒童結(jié)核病臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查不典型，傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養(yǎng)技術(shù)、結(jié)核菌素試驗(yàn)（tuberculin skin test ,TST）的陽(yáng)性率低而致診斷困難。近年來，結(jié)核病的診斷成為了備受關(guān)注的焦點(diǎn)。得利于科技的發(fā)展，結(jié)核的診斷技術(shù)有了很大進(jìn)步，同時(shí)也涌現(xiàn)出了不少新的檢查方法。

1 影像學(xué)診斷技術(shù)

X線平片在臨床上的應(yīng)用廣泛，可以確定肺部病變的范圍、性質(zhì)與類型，對(duì)多數(shù)肺結(jié)核可以診斷。一般來說，原發(fā)綜合征多顯示為肺內(nèi)片狀浸潤(rùn)影，病灶多發(fā)生在上葉尖后段和下葉背段；而多形性則是診斷浸潤(rùn)性肺結(jié)核的重要影像學(xué)依據(jù)，比如斑片狀浸潤(rùn)、空洞、結(jié)節(jié)、球形等。但在實(shí)際工作中，因小兒肺結(jié)核臨床表現(xiàn)不典型，且X線表現(xiàn)多樣，特別容易將片狀或帶狀浸潤(rùn)陰影的影像表現(xiàn)誤診為肺炎[2]。CT對(duì)于結(jié)核的診斷價(jià)值優(yōu)于胸部X線平片，能更為敏感地顯示出肺門淋巴結(jié)腫大，有助于發(fā)現(xiàn)肺門及縱隔腫大淋巴結(jié)或結(jié)核增殖灶和常規(guī)X線片不易發(fā)現(xiàn)的隱匿病灶、早期空洞病變及早期粟粒影[3]。此外，脊柱結(jié)核的診斷方面，磁共振成像(MRI)在顯示椎間盤破壞、狹窄、消失和脊髓及硬膜囊受壓等軟組織的改變兩個(gè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[4,5]。也有研究指出，超聲檢查在兒童早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中有重要輔助作用，即對(duì)于有局部關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限及伴或不伴低熱的患兒，若超聲檢查示干骺端骨質(zhì)破壞、軟組織膿腫及死骨形成，或有血流信號(hào)、關(guān)節(jié)積液及骨膜抬高，應(yīng)考慮骨結(jié)核可能[6]。

2 微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌涂片及培養(yǎng)

石炭酸復(fù)紅抗酸染色（Ziehl-Neelsen染色）作為傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌涂片的染色方法，一直被臨床廣泛使用，具有快速、簡(jiǎn)便且價(jià)廉的特點(diǎn)，為世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌確診結(jié)核菌感染的方法。但其靈敏度和特異度較差，不但對(duì)細(xì)菌的數(shù)量要求較高，且無法辨別死菌與活菌，也容易受到制片質(zhì)量的影響。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度高于涂片，且能夠區(qū)分死菌與活菌，但傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)，并不利于臨床的快速診斷。最近，具有對(duì)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)的自動(dòng)液體培養(yǎng)系統(tǒng)（如BD BACTEC MGIT系統(tǒng)）較傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)技術(shù)有顯著改進(jìn)[7]。來自成人的研究顯示，自動(dòng)液體培養(yǎng)系統(tǒng)的檢測(cè)增加了靈敏度，減少了檢測(cè)時(shí)間，后續(xù)還可做藥敏實(shí)驗(yàn)[8,9]。雖然目前還缺乏兒科的數(shù)據(jù)，但將其推廣到兒童結(jié)核病的診斷是值得期待的。

2.2 發(fā)光二極管熒光顯微鏡

發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED熒光顯微鏡）及檢測(cè)技術(shù)因其結(jié)合了 LED 光源與熒光顯微鏡，而具有鏡光柔和、光度純和干擾少等特點(diǎn)，且其檢測(cè)環(huán)境不受限制，使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格也相對(duì)低廉。WHO于2011年提出LED熒光顯微鏡逐步取代傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，作為以光學(xué)顯微鏡檢測(cè)方法[10]。有研究表明，LED熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡涂片陽(yáng)性率高出1.15%，且兩種鏡檢方法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而特異度幾乎相當(dāng)[11]。另外，使用LED熒光顯微鏡對(duì)人員的學(xué)歷背景及工作經(jīng)驗(yàn)要求較低，只需通過培訓(xùn)并熟練掌握之后即可開展檢測(cè)工作，故其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)有較大的推廣價(jià)值。

3 免疫學(xué)診斷技術(shù)

3.1 結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)（TST）

TST是由澳大利亞科學(xué)家發(fā)明的一個(gè)檢測(cè)方法，它以結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(purified protein derivative ,PPD) 為抗原，經(jīng)注射并刺激宿主引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)，使其局部出現(xiàn)皮膚硬結(jié)，根據(jù)硬結(jié)的平均直徑來反應(yīng)結(jié)核菌感染情況，是臨床常規(guī)檢測(cè)之一。雖然其具有簡(jiǎn)便、價(jià)廉的特點(diǎn)，但若機(jī)體免疫力低下可出現(xiàn)假陰性，使靈敏度降低[12]。另外，由于結(jié)核菌素試驗(yàn)使用的抗原是結(jié)核分枝桿菌和卡介苗菌株共同的抗原，也可使正常機(jī)體發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致假陽(yáng)性，影響特異度[13]。

3.2 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）使用特異性抗原（ESAT-6/CFP-10）來刺激機(jī)體，使其釋放大量γ-干擾素[14]，取全血并提取單核細(xì)胞，經(jīng)酶聯(lián)顯色后對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而判斷是否有結(jié)核桿菌感染。其提取的抗原由位于結(jié)核桿菌RD1區(qū)的相同操縱子所編碼，卡介苗（Bacillus Calmette Guérin ,BCG）均丟失該基因序列，且BCG 菌株和絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)，故該項(xiàng)檢測(cè)方法不受環(huán)境分枝桿菌及BCG接種影響，在一定程度上可以避免假陽(yáng)性[15,16]。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，T-SPOT.TB具有較高的靈敏度（80%～90%）及特異度（90%～98%）[17-19]。針對(duì)兒童結(jié)核病患者留痰困難，其血液標(biāo)本方便采集，具有較快的檢測(cè)速度（24 h即可出結(jié)果）而逐漸被廣泛使用。除了抽取外周血進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)之外，若其他標(biāo)本（如腦脊液、胸水、腹水）有足夠的淋巴T細(xì)胞亦可用于檢測(cè)，這有利于肺外結(jié)核病的診斷。另外，在結(jié)核病患者抗結(jié)核的治療過程中，T-SPOT.TB在一定程度上有監(jiān)測(cè)療效的作用，若抗結(jié)核治療有效，則T-SPOT.TB的斑點(diǎn)數(shù)會(huì)減少，部分患者T-SPOT.TB甚至可能轉(zhuǎn)陰。但T-SPOT.TB 檢測(cè)也有局限性，因?yàn)槠湓硎侨梭w對(duì)結(jié)核分枝特異性抗原的免疫反應(yīng)（而并非細(xì)菌本身），陽(yáng)性結(jié)果僅代表患者體內(nèi)存在被結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，故并不能區(qū)分患者是活動(dòng)性結(jié)核感染、既往感染還是潛伏性感染的狀態(tài)[20]。

3.3 其他診斷方法

有研究在成人中證實(shí)結(jié)核特異性T細(xì)胞CD27分子的改變可以區(qū)分結(jié)核病的活動(dòng)性與潛伏性，結(jié)核特異性T細(xì)胞CD27表達(dá)的喪失與結(jié)核抗原持續(xù)刺激和遷移至病灶有關(guān)。瑞士的研究者Portevin等[21]在來自坦桑尼亞的兒童中對(duì)這個(gè)推測(cè)進(jìn)行了研究，同時(shí)收集患兒的痰與外周血標(biāo)本，分別用于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和分離單個(gè)核細(xì)胞后進(jìn)行結(jié)核特異性抗原刺激，以進(jìn)行結(jié)核 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物（TAM-TB）的研究。TAM-TB 分析測(cè)定結(jié)核特異性 T 細(xì)胞表面 CD27 分子的熒光強(qiáng)度，計(jì)算丟失表面 CD27 分子的結(jié)核特異性 T 細(xì)胞與所有結(jié)核特異性細(xì)胞的比值從而進(jìn)行診斷。結(jié)果顯示該診斷方法的靈敏度為83.3%，特異度為96.8%。但目前用于TAM-TB診斷的臨界值來成人的研究，兒童相關(guān)研究很少，該項(xiàng)檢測(cè)方法是否適于兒童還需有更大的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

4 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

Xpert MTB／RIF是由美國(guó) Cepheid 開發(fā)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒，以半巢式實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，能夠?qū)颖镜臏?zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)集于一體[22]，已被世界衛(wèi)生組織推薦用于兒童結(jié)核病的診斷。該技術(shù)不僅能在2 h內(nèi)從患兒新鮮痰液中直接檢出是否含有結(jié)核分枝桿菌，還可通過檢測(cè)rpoB基因突變情況確認(rèn)是否存在利福平耐藥。該技術(shù)采用6 種分子信標(biāo)同時(shí)對(duì)6 種探針進(jìn)行檢測(cè)，其中有5種探針通過選擇性覆蓋rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)進(jìn)行耐藥檢測(cè)，另外1種探針作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。該技術(shù)只需將痰標(biāo)本處理后放入到反應(yīng)試劑盒中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)中基本不產(chǎn)生氣溶膠，極大程度地減少了操作中污染的可能性。由于Xpert MTB/RIF系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌量有一定要求，因此相對(duì)痰涂片陰性的標(biāo)本，痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本的靈敏度相對(duì)較高。但由于該試劑盒的價(jià)格昂貴，提高了檢測(cè)成本，故不利于臨床的推廣應(yīng)用。

5 芯片技術(shù)

5.1 蛋白芯片技術(shù)

結(jié)核生物蛋白芯片技術(shù)的原理是利用微陣技術(shù)，將結(jié)核菌的三種抗原即純化的脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan ,LAM）、結(jié)核分枝桿菌蛋白16 kD及38 kD固相在同一膜片上，加入待檢血清后，利用微孔濾膜的濃縮、凝集及滲濾作用，在固相膜上進(jìn)行快速的抗原抗體反應(yīng)，使用免疫金作為標(biāo)志物直接在膜上進(jìn)行顯色，通過對(duì)LAM、16 kD及38 kD三種特異性結(jié)核抗體進(jìn)行同步檢測(cè)，做出對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染情況的分析判斷[23]。結(jié)核蛋白芯片技術(shù)相較于傳統(tǒng)方法，具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)迅速的特點(diǎn)。蛋白芯片檢測(cè)具有高通量的特性，一次實(shí)驗(yàn)便可提供大量的信息，用于全面地研究蛋白表達(dá)譜；并且靈敏度較高，可以檢測(cè)出蛋白樣品中存在的微量蛋白；檢測(cè)速度也較快，只需幾分鐘就可以得到結(jié)果；另外，由于采用芯片識(shí)別閱讀儀判讀結(jié)果，可避免人為閱讀的主觀誤差。有研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白芯片檢測(cè)陽(yáng)性的診斷標(biāo)準(zhǔn)確定為聯(lián)合多項(xiàng)抗體陽(yáng)性時(shí)，可大幅度提高檢測(cè)的特異度[24]。但是IgG抗體的產(chǎn)生受機(jī)體免疫狀態(tài)、結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量等因素影響較大，如曾經(jīng)感染過結(jié)核的患者，IgG抗體往往也會(huì)是陽(yáng)性，不可避免的假陽(yáng)性導(dǎo)致過度診斷。

5.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片即DNA微陣列的原理是在微型載體上按微陣列的方式固定寡核苷酸，與帶標(biāo)記的待測(cè)DNA或mRNA雜交，據(jù)產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)弱來判斷靶DNA或mRNA中與芯片相應(yīng)基因的變異或表達(dá)。目前，基因芯片技術(shù)用于檢測(cè)成人結(jié)核病有良好的效果，也有兒童結(jié)核病使用基因芯片技術(shù)診斷的報(bào)道。有報(bào)道分別對(duì)結(jié)核病患兒與非結(jié)核病患兒進(jìn)行了結(jié)核桿菌抗酸染色涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)以及結(jié)核桿菌DNA微陣列芯片檢測(cè)比較，其發(fā)現(xiàn)DNA微陣列芯片檢測(cè)結(jié)核病患兒分枝桿菌的靈敏度（24.3%）略高于結(jié)核抗酸桿菌涂片(17.2%)及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(20.0%)[25]。基因芯片技術(shù)能在支持物上同時(shí)固定大量探針，因而只須一次雜交便可獲得大量信息。還可做耐藥相關(guān)研究，有報(bào)道稱基因芯片法和羅氏培養(yǎng)法在判斷是否存在異煙肼耐藥方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26]。但是基因芯片技術(shù)所需的設(shè)備昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，所以臨床上并不常規(guī)使用。

綜上所述，在診斷兒童結(jié)核病時(shí)，由于取得細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)較難，亟需快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)。隨著近些年的新技術(shù)的出現(xiàn)，多種有潛力的新診斷方法被開發(fā)并逐步在臨床應(yīng)用。各種方法各有優(yōu)劣，對(duì)兒童結(jié)核病的診斷還需結(jié)合臨床表現(xiàn)及多種檢查方法，取長(zhǎng)補(bǔ)短，進(jìn)行綜合診斷。相信在不久的將來，在通過對(duì)新技術(shù)的合理運(yùn)用后，結(jié)核病的診斷不再如此艱難，對(duì)兒童結(jié)核疫情的控制起到有利的作用。

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10.3969/j.issn.1000-3606.2017.11.019

2017-04-10)
(本文編輯：鄒 強(qiáng))