王俊慧，李 敏，闞 杰，劉瓦利

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院皮膚科，北京 100053；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室， 北京 100053)

白花蛇舌草是常用中草藥之一，近年來關(guān)于該藥物的臨床研究逐漸增多，其中以炎癥、感染性疾病和腫瘤的治療研究最為集中，其抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注[1]。

在皮膚疾病的治療中，主要集中于痤瘡、脂溢性皮炎、銀屑病治療方面。多項(xiàng)臨床研究提示，該藥物是用于治療銀屑病血熱證組方中的主藥之一[2-3]。

熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于自然界植物中，特別是在白花蛇舌草等中藥里含量豐富。近年來研究表明，熊果酸具有廣譜的抗腫瘤活性，且能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，還可影響腫瘤細(xì)胞周期的分布，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。

銀屑病是以角質(zhì)形成細(xì)胞良性增生為特點(diǎn)的一種免疫相關(guān)性疾病，其發(fā)病和信號傳導(dǎo)通路異常，與細(xì)胞凋亡與增生紊亂、血管生成等多方面因素相關(guān)。本課題組旨在通過本研究來探索熊果酸對正常人角質(zhì)形成細(xì)胞Hacat增殖及凋亡的影響，研究其對銀屑病的干預(yù)機(jī)理，并進(jìn)一步確定白花蛇舌草治療銀屑病的作用，同時(shí)明確熊果酸是否為銀屑病治療的主要單體成分。

1 材料與方法

1.1 試劑

Hacat 細(xì)胞株(由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮膚科饋贈)，RPMI 1640培養(yǎng)基粉劑(GIBCO 美國 921596)，凱基Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司，南京 KGA107)，凱基新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(凱基生物有限公司，南京),熊果酸(中國食品藥品檢定研究院，北京 110742-200518)以二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)助溶，并以含DMSO的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hacat細(xì)胞作為對照。

1.2 器材

酶標(biāo)儀(BIOTEK 美國)、醫(yī)用低速離心機(jī)(白洋，安新縣)、熒光倒置顯微鏡(Nicon，日本)、超凈工作臺(SANYON，日本)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYON，日本)、流式細(xì)胞儀(BD Fas calibur美國)、-20 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、DU640型紫外線分光光度計(jì)(BACKMAN 德國、高速冷凍離心機(jī)(BACKMAN 德國)。

1.3 使用WST-8法檢測熊果酸對Hcat細(xì)胞增殖影響

將Hacat細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至80%以上融合，傳代分至96孔板中，每孔添加10% RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/孔，添加不同濃度熊果酸(根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為3個(gè)熊果酸干預(yù)濃度： 0.1 mmol/L，0.05 mmol/L及0.025 mmol/L)進(jìn)行干預(yù)。以1%DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hacat細(xì)胞為對照，其干預(yù)時(shí)間為12 h和24 h。每孔加入新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測溶液10 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測每孔的吸光度。

1.4 使用流式細(xì)胞儀檢測熊果酸對Hacat細(xì)胞周期及凋亡的影響

將Hacat細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，無血清4 h以同步細(xì)胞周期；細(xì)胞貼壁約70%時(shí)添加干預(yù)藥物(添加濃度同前)，干預(yù)時(shí)間為12 h；收集細(xì)胞用冰乙醇固定(細(xì)胞周期檢測使用，凋亡不需要固定，可用不含EDTA胰酶消化后收集)。凱基Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒或者凱基細(xì)胞周期試劑盒孵育，上機(jī)檢測細(xì)胞周期，用Cell pro軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.5 觀察熊果酸對Hacat細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變

Hacat細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，細(xì)胞貼壁約70%時(shí)，添加藥物干預(yù)24 h后用PBS洗細(xì)胞2次，并在500 μL Binding Buffer中加入5 μL 的錨定蛋白(Annexin V, AV)和5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻。將上述液體滴加至6孔板中，使6孔板均勻覆蓋，避光并在室溫環(huán)境下反應(yīng)5 min。然后將培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下，使用雙色濾光片(FITC及羅丹明)進(jìn)行觀察，其中PI熒光信號呈紅色，Annexin V熒光信號呈綠色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果以O(shè)D值體現(xiàn)，將OD值轉(zhuǎn)換為細(xì)胞存活率進(jìn)行數(shù)據(jù)比較；細(xì)胞周期則按照各期所占比率進(jìn)行計(jì)算；基于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，使用細(xì)胞凋亡率進(jìn)行計(jì)算，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度熊果酸對Hacat細(xì)胞增殖影響

表1顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的熊果酸在對Hacat細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)12 h后，即可對其增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用(P<0.01)，各干預(yù)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著熊果酸濃度的升高，其對應(yīng)的OD值及細(xì)胞生存率均下降。由此可見，熊果酸對Hacat細(xì)胞的干預(yù)作用與其藥物濃度存在明顯的相關(guān)性，且藥物濃度越高對Hacat細(xì)胞的抑制作用也越明顯。

表1 熊果酸對Hacat細(xì)胞增殖的影響

注：與對照組比較：▲P<0.01

2.2 不同濃度熊果酸對Hacat細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

表2圖1、2顯示，小、中濃度(0.025 mmol/L、0.05 mmol/L)熊果酸對Hacat細(xì)胞的細(xì)胞周期具有明顯的阻滯作用，可將細(xì)胞阻滯于G1/G0期(P≤0.01)；且其抑制作用呈現(xiàn)出一定濃度的依賴性，中、小劑量干預(yù)下的G1/G0期及S期細(xì)胞分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)。另外值得注意的是，中濃度熊果酸干預(yù)后其中2例樣本出現(xiàn)二聚體峰(即凋亡峰)，推測可能是因?yàn)榈蛲黾?xì)胞主要為G1/G0期，所以S期細(xì)胞相對增多，因與其他標(biāo)本差異明顯故未納入統(tǒng)計(jì)分析。使用高濃度熊果酸進(jìn)行干預(yù)后，Hacat細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡或凋亡，細(xì)胞周期紊亂故也未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2 熊果酸對Hacat細(xì)胞周期分布的影響

注：為與對照組比較：▲P≤0.01

圖1 不同濃度熊果酸干預(yù)Hacat細(xì)胞周期分布圖 注：①②③④依次為對照組、低濃度熊果酸組、中濃度熊果酸組和高濃度熊果酸組

圖2 中濃度熊果酸干預(yù)Hacat細(xì)胞凋亡峰注：G1/G0期前淺色峰為凋亡峰，S期細(xì)胞分布較多，考慮為細(xì)胞在G1期凋亡所致

2.3 不同濃度熊果酸對Hacat細(xì)胞凋亡影響

2.3.1 使用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度熊果酸對Hacat細(xì)胞凋亡的影響 表3圖3顯示，在本實(shí)驗(yàn)中分別統(tǒng)計(jì)熊果酸干預(yù)后不同時(shí)期Hacat細(xì)胞凋亡率的改變，結(jié)果提示不同濃度的熊果酸都可以促進(jìn)Hacat細(xì)胞的凋亡。其中，小劑量組與對照組晚期凋亡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組與對照組早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高濃度熊果酸組與對照組早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)Hacat細(xì)胞凋亡率與熊果酸濃度呈線性相關(guān)(P<0.01)。

2.3.2 使用免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 圖4顯示，使用Annexin V-FITC試劑盒對凋亡細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果與流式細(xì)胞儀結(jié)果基本保持一致，不同濃度熊果酸均可誘導(dǎo)Hacat細(xì)胞凋亡。由于免疫熒光顯微鏡下視野有限，故未做統(tǒng)計(jì)分析。

圖3 不同濃度熊果酸干預(yù)Hacat細(xì)胞后凋亡象限圖注：子圖XC是熊果酸對照組，子圖XX是熊果酸小濃度組，子圖XZ是熊果酸中濃度組，子圖XD是熊果酸高濃度組。左上象限(UL)為細(xì)胞碎片或死亡細(xì)胞，右上象限(UR)為中晚期凋亡或死亡細(xì)胞，左下象限(LL)為存活細(xì)胞，右下象限(LR)為早期凋亡細(xì)胞

圖4 免疫熒光顯微鏡示熊果酸干預(yù)后Hacat細(xì)胞凋亡情況注：圖像放大倍數(shù)為10×20，①②③分別為小、中、高濃度熊果酸干預(yù)12 h后，Hacat細(xì)胞的熒光顯微圖像。其中，早期凋亡細(xì)胞PS外翻而被Annexin V-FITC 所結(jié)合，故呈強(qiáng)綠色；壞死細(xì)胞因細(xì)胞膜完整性喪失而被 PI 所染色，故呈強(qiáng)紅色或強(qiáng)紅+強(qiáng)綠色；而正常細(xì)胞既無PS外翻也未喪失細(xì)胞膜完整性，故不被 Annexin V -FITC和 PI 著色

組別例數(shù)早期凋亡率晚期調(diào)網(wǎng)率總調(diào)網(wǎng)率加DMSO對照組61 423±0 5033 833±0 7655 2570±1 2680 025mmol/L熊果酸62 127±0 7806 963±1 085◇9 0900±0 5370 05mmol/L熊果酸612 963±1 415△14 323±1 293△27 2870±2 697△0 1mmol/L熊果酸627 970±6 283△59 513±2 071△87 4833±4 907△

注：與對照組比較：△P<0.01，◇P<0.05

3 討論

隨著中藥化學(xué)現(xiàn)代化技術(shù)的進(jìn)步，中藥單體研究日益成為熱點(diǎn)。目前常用的200多味中藥都進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，并對單味中藥所提取的有效單體進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。已發(fā)現(xiàn)500多種活性單體，其中幾十種臨床療效確切，如青蒿素治療瘧疾、雷公藤皂甙治療免疫性疾病、黃連素治療腸道感染等[5]。

對有效中藥單體的研究和開發(fā)，能在一定程度促進(jìn)臨床療效提高，推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。然而中藥單體作為單一有效成分，其藥效并不能代表單味中藥，更不能代表組方的藥效。因此，目前有不少學(xué)者質(zhì)疑中藥單體是否屬于中藥范疇。筆者認(rèn)為，中藥單體研究至少在技術(shù)層面是一種進(jìn)步，能更加清楚地探究中藥的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組分；隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，當(dāng)信息量足夠大時(shí)，便可打通微觀與宏觀，更加完善對中藥屬性的整體把握。另外，中藥單體亦可獨(dú)自開發(fā)為成品藥物應(yīng)用于臨床。

本文研究結(jié)果表明，熊果酸作為白花蛇舌草的主要單體之一，能對體外培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞Hacat細(xì)胞增殖進(jìn)行有效抑制，且藥物濃度與抑制作用存在明顯相關(guān)性。中、小濃度的熊果酸可以將Hacat細(xì)胞阻滯于G1/G0期，并對Hacat細(xì)胞RNA、 cAMP，cGMP的合成造成直接影響。本研究對于細(xì)胞周期的影響研究結(jié)果，與其他肝癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的研究結(jié)果具有一致性。此外，熊果酸能誘導(dǎo)Hacat細(xì)胞凋亡， 其濃度與Hacat細(xì)胞的凋亡率呈正比。由此可見，熊果酸對于維持角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及凋亡的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

目前，關(guān)于熊果酸研究最困惑的是其生物利用度的問題。體外研究已證實(shí)，該單體能夠有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境后其生物利用度低，尚不能開發(fā)為成品藥物。如何提高該藥物的生物利用度，值得進(jìn)一步深入研究。

此外，銀屑病不僅存在角質(zhì)形成細(xì)胞的高速增殖與分化，還存在著異常的細(xì)胞凋亡[6]，該病的發(fā)生發(fā)展是多種基因、多種細(xì)胞、多條信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)共同作用的結(jié)果。本研究對熊果酸干預(yù)Hacat細(xì)胞增殖與凋亡的初步研究，其關(guān)鍵療效機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究與探索。

[1] 紀(jì)寶玉,范崇慶,裴莉昕,等.白花蛇舌草的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014,20(19):235-240.

[2] 曹蕭蕭,徐榮,李福倫,等.銀屑病的中醫(yī)治療[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,25(1):117-118.

[3] 齊志峰,楊志波,唐雪勇.從中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說論述銀屑病的發(fā)病原因及治療[J].江西中醫(yī)藥,2012,43(9):8-9.

[4] 孫澄玥,戚榮鑫,張茜,等.熊果酸在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016, 16(22):4393-4397.

[5] 陳秀梅,高顏華.淺談中藥現(xiàn)代化研究的進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2011,9(24):128-129.

[6] 李紅文,丁一,雍磊.銀屑病患者皮損中細(xì)胞衰老、增殖和凋亡檢測[J].中華皮膚科雜志，2002,32(1):213-215.