田新紅，郝 莉，游言文，徐玉英，于世奇

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450008)

學(xué)習(xí)記憶障礙是阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)的主要臨床表現(xiàn)，β淀粉樣蛋白(amyliod-βprotein, Aβ)沉積形成老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、突觸丟失是AD的主要病理學(xué)改變，其中Aβ引起的突觸丟失是AD學(xué)習(xí)記憶障礙的主要原因[1-2]。突觸蛋白1(Synapsin-1)是一種與突觸結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)的膜蛋白。自噬又稱為Ⅱ型細胞死亡，是細胞在自噬相關(guān)基因(autophagyrelated gene，Atg)調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損細胞器和大分子物質(zhì)的過程。自噬相關(guān)基因1(Beclin1)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3) 是哺乳動物細胞自噬的主要相關(guān)基因。已有研究證實，AD患者與動物模型大腦自噬水平上調(diào)類同[3]，自噬是突觸丟失的主要方式[4-5]。

中藥銀杏葉提取物可改善AD相關(guān)學(xué)習(xí)記憶力下降,而銀杏內(nèi)酯B(Ginkgobalide B,GB)是銀杏葉提取物的主要活性成分，具有保護神經(jīng)元、促進學(xué)習(xí)和改善記憶的作用[6]。實驗證實，GB可改善AD相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶缺陷[7]，然而其具體作用機制尚未闡明。 本研究建立Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠模型，腹腔注射中藥單體GB，從行為學(xué)和分子生物學(xué)角度探討GB改善AD相關(guān)學(xué)習(xí)記憶能力下降及突觸相關(guān)蛋白Synapsin-1、自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在其中的作用，為中藥單體防治AD提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑儀器

雄性清潔級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由河南實驗動物中心提供(合格證號SCXK (豫)2010-0002)。GB購自中國食品藥品檢定研究院；Aβ1-42購自Sigma公司；兔單克隆一抗Synapsin-1、Beclin1和LC3購自Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；Tecnai-12透射電鏡購自飛利浦公司；萊卡顯微成像系統(tǒng)購自萊爾公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)購自天能公司；VCX130 超聲破碎儀購自美國Sonics 公司；Stepone 實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 AD動物模型建立 SD大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭固定于腦立體定位儀上，參考大鼠腦立體定位圖譜：正中做一切口暴露出前囟，以前囟為原點向后4 mm，旁開2.5 mm 左右各鉆一孔，硬腦膜下3 mm至兩側(cè)海馬。由微量注射器將2 μL(10μg)Aβ1-42在10 min內(nèi)注射完畢，留針10 min，使得Aβ1-42充分浸潤局部組織，術(shù)后均注射抗生素防止感染。假手術(shù)組大鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 分組及治療 將SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(8只)、模型組(8只)、GB低劑量組(15只)、中劑量組(15只)5組和高劑量組(15只)。模型造成3 d后，GB低、中、高劑量組腹腔注射GB，劑量分別為每天2.5、5和7.5 mg/kg，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，均為15 d。

1.2.3 Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力 測試期間室內(nèi)保持安靜，水池內(nèi)注入清水并加入墨汁至水不透明，水面高出平臺2 cm。第1天進行預(yù)實驗讓大鼠適應(yīng)環(huán)境，同時將其引導(dǎo)到平臺。其后4 d，大鼠每日從不同入水點放入水中， 找到平臺時間即逃避潛伏期，逃避潛伏期記錄為60 s。第6天撤除平臺，將大鼠從任一處放入水池，測試60 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)。行為學(xué)檢測期間仍對大鼠進行GB治療。

1.2.4 透射電鏡檢測自噬 水迷宮實驗結(jié)束后1 h，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔暴露心臟，灌注生理鹽水沖洗血管，灌注2.5%戊二醛固定。剝離鼠腦，取約1 cm3海馬CA1區(qū)組織，置于戊二醛中固定并用磷酸漂洗，乙醇脫水、丙酮包埋，固化、切片、染色，透射電鏡觀察、拍片。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測Synapsin-1、Beclin1和LC3表達 灌注預(yù)冷的多聚甲醛進行固定?？焖贁囝^取腦，多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片。脫蠟、修復(fù)、PBS清洗，血清封閉，37 ℃孵育20 min；滴加一抗(兔抗Synapsin-1、Beclin1和LC3，稀釋1∶200)，37 ℃孵育過夜；加HRP標記二抗，孵育、DAB顯色，中性樹膠封片。選取海馬CA1區(qū)不重疊的5個高倍視野，計算其陽性光密度值。

1.2.6 熒光定量PCR檢測海馬組織Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA表達 按照Trizol試劑盒說明書從冰凍海馬組織中快速提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。Synapsin-1上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′，下游引物：5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；Beclin1上游引物：5′-GTTCTCTCAGTTGCCTTTC-3′，下游引物：5′-AGCTGTAACCTGTCGCCGAGTCCC-3′；LC3-Ⅱ上游引物：5′-CGGGTTGAGGAGACACACAA-3′，下游引物：5′-ATGAGCCGGACATCTTCCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3′，下游引物：5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′，均由上海生工生物有限公司合成。按照試劑盒說明書進行擴增,PCR反應(yīng)總體積為25 μL,反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s,35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。由系統(tǒng)軟件自動生成循環(huán)域值(Ct)。每個樣品均做3個平行孔，取平均值作為該樣品的Ct值,并計算出Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠 Morris 水迷宮結(jié)果

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期延長(P<0.05),去掉平臺后模型組穿越原平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)；腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 15 d后，中、高劑量組平均逃避潛伏期時間縮短(P<0.05),穿越原平臺次數(shù)增加(P<0.05),行為學(xué)結(jié)果提示GB具有改善 AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶下降的能力。

表1 各組大鼠 Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元電鏡觀察自噬結(jié)果

圖1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠電鏡自噬體結(jié)構(gòu)較明顯。隨著GB治療劑量的增加 ，可觀察到自噬體結(jié)構(gòu)逐漸不明顯。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬電鏡觀察結(jié)果(20000×)注：▲代表自噬體

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表達

圖2表2顯示， Synapsin-1的陽性表達部位主要在細胞核周圍的細胞質(zhì)中，呈深黃色或褐色，細胞核呈藍色。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1蛋白表達降低(P<0.05)呈弱陽性。隨著腹腔注射GB劑量的增加，Synapsin-1蛋白表達逐漸上升呈強陽性，其中GB高劑量組作用最強(P<0.05)。 LC3和Beclin-1主要定位于海馬神經(jīng)元細胞質(zhì)中，陽性表達呈棕色。假手術(shù)組僅有少量陽性細胞，且著色淺淡；模型組中LC3和Beclin-1胞質(zhì)的染色程度加深，陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。與模型組比較，隨著腹腔注射GB劑量的增加，Beclin-1的表達程度及陽性細胞數(shù)逐漸減少(P<0.05)，而LC3有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示GB具有提高 AD大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1，降低Beclin-1蛋白表達的能力(圖中箭頭分別表示陽性細胞)。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)免疫組化Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白表達(400×)

表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Synapsin-1 mRNA水平下降(P<0.01)，Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA水平表達升高(P<0.05)；與模型組比較，GB治療中、高劑量組Synapsin-1和Beclin1 mRNA相對表達量分別增加和降低(P<0.05)；與模型組比較，GB治療中劑量組LC3-ⅡmRNA表達量有降低趨勢(P>0.05)，高劑量組表達量明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表達

注：與假手術(shù)組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討論

本研究選擇使用Aβ1-42硬腦膜下注射大鼠兩側(cè)海馬建立AD動物模型。學(xué)習(xí)記憶障礙是AD的主要臨床表現(xiàn)，Morris水迷宮是檢測學(xué)習(xí)記憶能力的主要行為學(xué)方法。它通過讓受試動物在水環(huán)境中尋找隱匿平臺，并分析其找到平臺所需時間(逃避潛伏期)及動物穿越隱匿平臺的次數(shù)來判斷空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究通過Morris水迷宮檢測AD動物模型的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果與正常組比較，AD模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長，去除平臺后模型組穿越原平臺的次數(shù)減少，說明Aβ1-42建立的大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示AD動物造模成功，可被用于后續(xù)的實驗。

Morris水迷宮中逃避潛伏期越短、穿越隱匿平臺的次數(shù)越多，表明受試動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力越好。本研究在Morris水迷宮行為學(xué)檢測時觀察到，與AD模型組比較，隨著腹腔注射GB劑量的增加，治療組大鼠逃避潛伏期時間縮短，穿越原平臺次數(shù)明顯增加，提示中、高劑量即5和7.5 mg/kg的中藥單體GB具有改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶下降的能力。

已有研究證實，AD病人和動物模型腦中均存在突觸丟失[8-9]，且突觸丟失較神經(jīng)元數(shù)量減少更顯著。突觸丟失是AD的一個主要病理學(xué)特征，是學(xué)習(xí)記憶障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10-11]。促進突觸丟失的主要原因，是病理情況下β淀粉樣前體蛋白(amyliod precursor protein,APP)被2種分泌酶切割產(chǎn)生Aβ，主要是由39～43個氨基酸組成的Aβ40和Aβ422種分子，其中Aβ42比Aβ40疏水性強，易聚集、 易導(dǎo)致AD老年斑塊的形成[12]。Aβ是AD最主要的突觸毒素,可破壞海馬腦片或動物的長時程增強,降低樹突棘密度影響學(xué)習(xí)記憶[13]。Synapsin-1是進化中高度保守的蛋白質(zhì)，定位于突觸囊泡膜上，是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的特征性膜蛋白，其數(shù)量和分布密度可間接反映突觸的密度。AD小鼠模型中，SynapsinⅠ表達水平明顯降低。海馬是參與學(xué)習(xí)記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，也是AD病人腦中最易受累的區(qū)域之一。本研究觀察到，Aβ1-42建立的AD大鼠模型海馬組織SynapsinⅠmRNA和蛋白表達下降與文獻基本一致。使用中、高劑量的銀杏內(nèi)酯B可增加SynapsinⅠ水平。GB是銀杏葉提取物的主要單體。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可改善衰老鼠學(xué)習(xí)記憶力下降[14-15]，且與其提高海馬神經(jīng)元SynapsinⅠ表達相關(guān)。AD是與衰老密切相關(guān)的疾病，學(xué)習(xí)記憶力下降是其主要臨床癥狀。結(jié)合本研究觀察到的結(jié)果提示，銀杏葉提取物主要可能是通過其中的單體GB改善衰老相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶，而這種改善可能與大鼠海馬突觸蛋白SynapsinⅠ表達水平增加有關(guān)。

本研究通過透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，模型組出現(xiàn)的自噬體大多位于細胞核旁，GB可減少細胞內(nèi)自噬體數(shù)量。自噬與突觸丟失相關(guān)，AD動物模型SAMP8小鼠的海馬神經(jīng)元突觸丟失伴隨LC3陽性細胞數(shù)的增加[5]。LC3 是酵母 Atg8 的哺乳動物同源體，是公認的哺乳動物細胞自噬標志物。免疫組化方法檢測到AD模型大鼠海馬LC3蛋白表達增加，與文獻基本一致；而GB對LC3影響不明顯差異無統(tǒng)計學(xué)意義。自噬發(fā)生時，pro-LC3 被加工成胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)。經(jīng)自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene-5, ATG5) 和自噬相關(guān)基因-3(autophagy related gene-5, Atg3)催化，LC3-Ⅰ酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N膜結(jié)合形式即 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化而來，LC3-Ⅱ的含量已被證實與自噬體形成有關(guān)。由于哺乳動物細胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白能夠調(diào)控自噬體形成，其表達水平的高低在某種程度上可反映細胞自噬活性[16]。為進一步探討銀杏內(nèi)酯B對LC3的影響，又檢測了LC3- ⅡmRNA，結(jié)果顯示中、高劑量GB可降低AD模型大鼠海馬LC3-ⅡmRNA表達水平。Beclin1基因是酵母ATG6的同系物，調(diào)節(jié)啟動自噬體的形成，也是哺乳動物細胞自噬的特異性基因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Beclin1在AD腦中的表達增加。本研究AD模型大鼠海馬Beclin1 mRNA和蛋白表達升高，腹腔注射不同劑量的GB后，Beclin1表達水平下降。

臨床上銀杏葉提取物已被應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的防治，GB是銀杏葉提取物的主要有效成分之一。本研究觀察到，GB可改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶力下降，提高突觸相關(guān)蛋白SynapsinⅠ表達，這些作用可能與GB降低海馬神經(jīng)元自噬水平有

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