姜 楠，袁曉雯，薛 欣，陶旭光，喬艷雪，李 蕊，陳 冰，李玉梅，胡鏡清△△，馬雅鑾△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 100015； 3. 新發(fā)突發(fā)傳染病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100015)

高脂血癥(hyperlipidemia, HP)的發(fā)生與長(zhǎng)期攝入高脂飲食、脂質(zhì)代謝障礙有關(guān)。高血脂不僅觸發(fā)和加速動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，還可引起肝臟脂質(zhì)代謝負(fù)擔(dān)加重，導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病(none- alcholic fatty liver disease，NAFLD)[1-2]。高脂血癥引發(fā)機(jī)體全身慢性的炎癥反應(yīng)，與炎性細(xì)胞因子、單核/巨噬細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫損傷過(guò)程密切相關(guān)[3]。因此，采用藥物減輕高脂所致的免疫損傷，可以抑制或延緩高脂血癥向AS和NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

祛痰化瘀方是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所胡鏡清研究員多年來(lái)治療高脂血癥/AS與心腦疾病等痰瘀互結(jié)證的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究證實(shí)，祛痰化瘀方具有抗炎和抗AS作用[4-5]。活血方是祛痰化瘀方的精簡(jiǎn)方，主要包括桃仁、生地、丹皮、干姜、羌活等活血類藥物。AS斑塊可由氣血虛而寒痰凝滯所致，呈現(xiàn)漫腫無(wú)頭、色澤不變、不熱不疼的陰疽癥狀。治療陰疽的代表方陽(yáng)和湯出自《外科證治全生集》為溫里劑，具有溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒通滯之功效，文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)AS和冠心病具有治療作用[6-8]。本文采用apoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)，探討并比較活血方與陽(yáng)和湯能否緩解高脂所致的免疫壓力，以及延緩AS斑塊形成和NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

活血方組成：桃仁、生地、丹皮、干姜、羌活、黃連,陽(yáng)和湯組成：熟地、肉桂(去皮研粉)、麻黃、鹿角膠、白芥子、姜炭、生甘草,活血方和陽(yáng)和湯藥材購(gòu)于北京同仁堂藥店;抗小鼠CD11b-PercpCy5.5、Gr1-APC、CD48-FITC、TLR4-PE抗體和紅細(xì)胞裂解液為美國(guó)BD Pharmingen公司產(chǎn)品;小鼠細(xì)胞因子Bio-Plex懸液芯片試劑盒購(gòu)自MERCK公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自Quagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、小鼠實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceralde hyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a)、白介素1β(Interleukin-1β, IL-1b)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemo- attractant protein-1, MCP-1)、干擾素-g(interferon-g, IFN-g)和一氧化氮合酶-2(nitric oxide synthase-2, NOS-2) 購(gòu)自ABI公司；生化試劑購(gòu)于日本和光公司；FACS Callibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；Bio-PlexTM 200 System懸液芯片檢測(cè)儀和C1000TMThermal Cycler實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;BECKMAN CX4全自動(dòng)生化分析儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品。

1.2 分組及處理

所有實(shí)驗(yàn)用鼠均購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2011-0012)，并飼養(yǎng)于SPF條件下。實(shí)驗(yàn)采用10周齡野生C57BL/6和apoE-/-雌性小鼠，體質(zhì)量(20±2 g)，每組8只。高脂飼料含78.85%基礎(chǔ)飼料，0.15%膽固醇，21%脂肪。C57BL/6+普食為對(duì)照；apoE-/-小鼠分為apoE-/-+普食、apoE-/-+高脂、apoE-/-+高脂+活血方、apoE-/-+高脂+陽(yáng)和湯干預(yù)組。干預(yù)組每天給予臨床等效劑量，其他小組采用等量純凈水灌胃。

18周后，小鼠在異戊烷吸入麻醉下摘眼球采EDTA抗凝血，離心800 g 10 min后獲取血漿，-80 ℃保存，用于生化檢測(cè)和細(xì)胞因子懸液芯片檢測(cè)備用。血細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，剝離胸腹主動(dòng)脈和肝臟用于病理檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.3 血脂水平測(cè)定

BECKMAN CX4全自動(dòng)生化分析儀，日本和光公司試劑，常規(guī)測(cè)定各組血漿膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)水平。

1.4 外周血單核細(xì)胞及表面受體TLR4的表達(dá)檢測(cè)

血細(xì)胞加入獲取血漿等量的PBS，加1X紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，應(yīng)用抗小鼠CD11b-PercpCy5.5、Gr-1-APC、CD48-FITC和TLR4-PE抗體直接法標(biāo)記外周血白細(xì)胞，F(xiàn)ACS Callibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組動(dòng)物外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞亞型比例及其表面toll樣受體(Toll-like receptor 4, TLR4)的表達(dá)[5]。

1.5 細(xì)胞因子測(cè)定

各組動(dòng)物血漿應(yīng)用小鼠細(xì)胞因子懸液芯片試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，Bio-PlexTM 200 System懸液芯片檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、Il-1β、IL-6、MCP-1、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和TNFα的表達(dá)水平。

1.6 病理染色

剝離胸腹主動(dòng)脈用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明浸蠟、包埋、切片、攤片、HE染色后觀察。取肝臟右上葉用4%多聚甲醛固定，經(jīng)20%蔗糖脫水，OCT包埋、冰凍切片油紅O染色。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

剝離胸腹主動(dòng)脈，剪取其主動(dòng)脈弓少量的胸主動(dòng)脈約1 cm，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用C1000TMThermal Cycler實(shí)時(shí)定量PCR儀熒光定量PCR檢測(cè)炎性因子TNF-a、IL-6、MCP-1、IFN-γ、NOS2和IL-1b 表達(dá)，使用ABI SDS 7500軟件分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血脂和肝功能水平變化

表1顯示，普食狀態(tài)下apoE-/-小鼠血脂TC和LDL水平顯著高于C57BL/6小鼠，HDL水平顯著低于野生小鼠(P<0.01)。18周高脂飲食apoE-/-模型小鼠的TC和LDL水平顯著增高(P<0.01)；給予活血方和陽(yáng)和湯干預(yù)后，模型小鼠TC、TG、LDL和HDL水平未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。C57BL/6小鼠比較，apoE-/-普食小鼠肝功能ALT水平升高(P<0.05)，AST水平無(wú)明顯改變(P>0.05)；18周高脂飲食apoE-/-模型小鼠的ALT和AST水平無(wú)明顯改變(P>0.05)；活血方和陽(yáng)和湯干預(yù)后模型小鼠ALT、AST水平未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。

表1 各組小鼠血脂和肝功能水平比較

注：與野生普食組比較：*P<0.05,**P<0.001;與apoE-/-高脂組比較:▲▲P<0.001

2.2 外周血單核細(xì)胞及其炎癥亞型比例以及表面受體TLR4表達(dá)水平比較

表2顯示，飼養(yǎng)18周后apoE-/-普食小鼠與C57BL/6小鼠比較，外周血單核細(xì)胞及其Ly6C++比例無(wú)明顯變化(P>0.05)，表面受體TLR4表達(dá)水平無(wú)明顯影響。18周的高脂飲食顯著增加apoE-/-鼠外周血單核細(xì)胞比例(P<0.05)和Ly6C++比例(P<0.05)，其表面受體TLR4表達(dá)有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；钛礁深A(yù)18周后，單核細(xì)胞及其炎癥亞型Ly6C++比例顯著降低(P<0.05)，單核細(xì)胞和Ly6C++表面受體TLR4水平顯著降低(P<0.05)；陽(yáng)和湯干預(yù)后，單核細(xì)胞比例無(wú)明顯改變，但Ly6C++比例顯著降低(P<0.05)，單核細(xì)胞和Ly6C++表面受體TLR4水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組動(dòng)物單核細(xì)胞及Ly6C++亞型比例與表面受體TLR4表達(dá)水平比較

注：與野生普食組比較：*P<0.05;與apoE-/-高脂組比較:▲▲P<0.01

2.3 血漿細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較

表3顯示，我們采用懸液芯片檢測(cè)各組小鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-普食小鼠血漿細(xì)胞因子IL-10、Il-1β、IL-6、MCP-1、M-CSF和TNFα表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05)，高脂飲食的apoE-/-小鼠除MCP-1和M-CSF表達(dá)水平顯著增高外(P<0.05)，IL-10、IL-1b和TNFα水平增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；活血方干預(yù)后，小鼠血漿細(xì)胞因子M-CSF水平顯著降低(P<0.05)，Il-1β、IL-10、MCP-1和TNFα水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)和湯干預(yù)后，細(xì)胞因子水平與高脂飲食組比較無(wú)明顯改善。

表3 各組動(dòng)物血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平

注：與野生普食組比較：*P<0.05;與apoE-/-高脂組比較:▲P<0.05

2.4 各組動(dòng)物主動(dòng)脈細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平比較

圖1表4顯示，10周齡apoE-/-小鼠普食飼養(yǎng)18周后，病理檢測(cè)可見(jiàn)明顯的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。因主動(dòng)脈血管粥樣硬化斑塊不規(guī)則且分布不均勻，難以鏡下定量比較，因此我們?nèi)≈鲃?dòng)脈根部1 cm組織提取mRNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)主動(dòng)脈血管局部炎癥因子表達(dá)。

圖1 HE染色檢測(cè)主動(dòng)脈病理組織變化比較

組 別TNF-αIL-6MCP-1IFN-γNOS-2IL-1βC57BL/6+CD1.18±0.86▲▲1.36±1.171.40±1.48▲▲1.49±1.96▲1.12±0.551.11±0.62▲▲apoE-/-+CD1.91±0.87▲▲0.64±0.401.83±0.98▲▲5.01±2.58?1.11±0.382.31±1.13?▲▲apoE-/-+WD11.73±5.93??0.92±1.066.58±3.26??5.54±1.81?1.67±1.129.69±4.87??apoE-/-+WD+HXF0.17±0.05?▲▲0.08±0.04?▲0.30±0.06?▲▲0.32±0.09▲▲0.50±0.230.69±0.24▲▲apoE-/-+WD+YHT0.30±0.04?▲▲0.62±0.270.36±0.11▲▲1.99±0.50▲▲0.59±0.090.73±1.00▲▲

注：與野生普食組比較：*P<0.05,**P<0.01;與apoE-/-高脂組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖2 油紅O染色檢測(cè)肝臟病理組織變化比較

與既往研究結(jié)果一致，野生普食小鼠比較，apoE-/-普食小鼠主動(dòng)脈血管壁炎癥因子IL-1b和 IFN-g mRNA水平顯著升高(P<0.05)；而接受高脂飲食后，apoE-/-小鼠主動(dòng)脈血管壁炎癥因子TNFα、Il-1b、MCP-1和 IFN-γ mRNA水平顯著升高(P<0.01和P<0.05)，提示高脂血癥導(dǎo)致顯著的血管炎癥反應(yīng)?；钛礁深A(yù)18周后，TNFα、Il-1b、MCP-1、IFN-γ和NOS-2 mRNA水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)，陽(yáng)和湯干預(yù)后，TNFα、Il-1b、IL-6、MCP-1、IFN-γ和NOS-2 mRNA水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)，提示活血方和陽(yáng)和湯均可減輕高脂導(dǎo)致的主動(dòng)脈血管局部免疫損傷，活血方對(duì)血管局部的作用較陽(yáng)和湯顯著。

2.5 各組動(dòng)物肝臟病理檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平比較

圖2顯示，10周齡apoE-/-小鼠普食飼養(yǎng)18周后，肝臟油紅O染色可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)富含脂滴，油紅O染色呈陽(yáng)性，給予高脂飲食后，可見(jiàn)油紅O染色陽(yáng)性增強(qiáng)；活血方組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴含量減少，而油紅O染色呈現(xiàn)以血管為中心油紅O染色減弱；陽(yáng)和湯組肝臟油紅O染色較模型組稍弱。

表5顯示，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組肝臟組織炎癥因子與主動(dòng)脈血管組織結(jié)果一致。與野生普食小鼠比較，apoE-/-普食組小鼠肝臟組織炎癥因子TNFα、MCP-1和IL-1b mRNA水平顯著升高(P<0.01)，IL-6、IFN-γ和NOS-2 mRNA水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)；而接受高脂飲食后，apoE-/-小鼠肝臟組織炎癥因子TNFα、MCP-1和IL-6 mRNA水平進(jìn)一步升高(與apoE-/-普食組比較P<0.01和P<0.05)，提示apoE-/-基因敲除導(dǎo)致顯著的肝臟炎癥反應(yīng)，高脂飲食進(jìn)一步加重肝臟免疫損傷。活血方干預(yù)18周后，TNFα、MCP-1、IL-1b、IL-6、IFN-γ和NOS-2mRNA水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)；陽(yáng)和湯干預(yù)后，TNFα、MCP-1、IL-1b、IL-6和NOS-2mRNA水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)，提示活血方與陽(yáng)和湯均可以減輕高脂導(dǎo)致的肝臟免疫損傷，活血方減輕肝臟損傷效果較陽(yáng)和湯顯著。

表5 各組動(dòng)物肝臟炎癥因子相對(duì)mRNA表達(dá)水平比較

注：與野生普食組比較：*P<0.05,**P<0.01;與apoE-/-高脂組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

3 討論

高脂血癥促進(jìn)AS和NAFLD形成[1-2]，其中LDL-C是CHD及AS的危險(xiǎn)因素，且與肝臟TG含量密切相關(guān)[9]。肝臟脂肪病變會(huì)通過(guò)提高血漿中TC、LDL-C的濃度，降低HDL-C的濃度加重AS的進(jìn)展[10]。免疫損傷是AS和NAFLD的共性特征[11]。長(zhǎng)期高血脂促進(jìn)氧化應(yīng)激、ox-LDL造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化并分化成巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞沉積于血管壁形成AS[12]。同時(shí)大量的游離脂肪酸、甘油進(jìn)入肝臟，超過(guò)肝臟的消化、轉(zhuǎn)化、代謝能力，大量的脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，并通過(guò)Kupffer細(xì)胞、細(xì)胞因子等復(fù)雜的炎癥和免疫機(jī)制誘導(dǎo)NAFLD的形成[13]。因此，高脂血癥導(dǎo)致慢性全身性炎癥狀態(tài)，加重血管和肝臟局部炎性病變[9]，加劇AS和NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

本研究采用apoE-/-小鼠18周高脂飲食，從模型組血脂水平和主動(dòng)脈血管HE染色檢測(cè)到AS斑塊，說(shuō)明AS模型成功。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織油紅O染色陽(yáng)性，病理特征有明顯的肝細(xì)胞脂肪病變。結(jié)合模型組血脂，參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)2010年所推薦的NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，可將模型組小鼠診斷為NAFLD。在上述研究基礎(chǔ)上，我們采用高脂飲食喂飼apoE-/-小鼠，分別給予活血方和陽(yáng)和湯干預(yù)18周，探討和比較2種方劑對(duì)于AS并發(fā)NAFLD小鼠的作用。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，活血方能減輕高脂所致的免疫損傷，不僅改善AS還可抑制NAFLD；陽(yáng)和湯的免疫調(diào)節(jié)作用較活血方弱，對(duì)AS和NAFLD抑制作用也不如活血方顯著。我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，活血方與陽(yáng)和湯對(duì)于AS和NAFLD防治作用并不依賴于降脂，而是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮作用。另外給藥干預(yù)18周，肝功能無(wú)明顯改變，說(shuō)明18周活血方與陽(yáng)和湯干預(yù)未造成藥物性肝損傷。

研究證明，免疫損傷在AS和NAFLD發(fā)生發(fā)展中在起重要作用，表現(xiàn)為一系列的全身和局部炎癥反應(yīng)[13]。對(duì)于系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，活血方降低外周血單核細(xì)胞、炎癥型單核細(xì)胞比例及其表面受體TLR4表達(dá)，陽(yáng)和湯僅僅降低炎癥型單核細(xì)胞比例和表面受體TLR4表達(dá)；對(duì)于血漿炎癥因子，活血方降低炎癥因子M-CSF、IL-10、IL-1b、MCP-1和TNF-a水平，陽(yáng)和湯僅僅降低TNF-a水平，可見(jiàn)對(duì)于系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)活血方抗炎作用強(qiáng)且全面，陽(yáng)和湯作用弱且局限。對(duì)于血管和肝臟局部的免疫損傷，活血方和陽(yáng)和湯明顯降低主動(dòng)脈血管炎癥因子TNF-a、MCP-1、IFN-γ、NOS2和IL-1b表達(dá)，活血方降低效果更為顯著?；钛胶完?yáng)和湯的抗炎機(jī)制不同、作用強(qiáng)度不同，導(dǎo)致的作用結(jié)果也不相同。長(zhǎng)期干預(yù)活血方減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，陽(yáng)和湯改善血管肝臟病理?yè)p傷不如活血方明顯。我們推測(cè)，活血方因活血行氣，氣行則血行，通過(guò)氣行和血行廣泛作用于全身血管乃至微血管，且作用直接而快速。陽(yáng)和湯溫陽(yáng)疏布，作用于整體緩慢而溫和，相形之下抗炎抗AS效果較慢且弱，不如活血方立竿見(jiàn)影。

雖然活血方與陽(yáng)和湯免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制、作用強(qiáng)度不同，但是我們發(fā)現(xiàn)，不論是活血方還是陽(yáng)和湯對(duì)于局部炎癥反應(yīng)影響要優(yōu)于對(duì)其全身炎癥反應(yīng)的影響，我們推測(cè)與選擇的疾病模型、疾病發(fā)生部位直接相關(guān)，治療的目標(biāo)是改善病變部位，所以活血方與陽(yáng)和湯的主要免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)在血管和肝臟局部。

綜上所述，活血方干預(yù)主要抑制apoE-/-小鼠

關(guān)。AD自噬的激活影響β-分泌酶(BACE1)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解，增加了軸突BACE1積累，使得β-淀粉樣前體(APP)在BACE1作用下裂解產(chǎn)生過(guò)多的Aβ[17]。已有學(xué)者提出， AD病人大腦皮層和海馬神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)存在數(shù)量較多的自噬體，LC3-Ⅱ表達(dá)升高[18]；老齡AD小鼠腦內(nèi)自噬高于正常，LC3-Ⅱ蛋白水平也增加[19]。Beclin1也參與Aβ代謝，所以自噬參與 Aβ生成和代謝。本研究AD模型大鼠海馬LC3、Beclin1表達(dá)升高，自噬上升可影響神經(jīng)元Aβ水平[19]，使用GB后AD大鼠海馬LC3和Beclin1降低。結(jié)合上述討論認(rèn)為，GB降低自噬可能是通過(guò)減少神經(jīng)元自噬體數(shù)量及Aβ及其前體APP、提高突觸蛋白表達(dá)、減少突觸丟失、改善學(xué)習(xí)記憶的。自噬與AD聯(lián)系密切，GB通過(guò)調(diào)控自噬改善AD相關(guān)學(xué)習(xí)記憶，但其中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，以期為闡明GB改善AD學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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