陳旭征，曹治云，林 薇，鄭良樸，章尤權(quán)，陳惠云，王少珍，林佳佳，杜 建

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003； 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)介導(dǎo)的免疫抑制在其中又發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。扶正抑瘤方在臨床上主要用于術(shù)后放化療期間或晚期不能手術(shù)的正氣虛弱的消化道腫瘤患者的輔助治療，能顯著提高腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能[2]。然而其調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制仍不明確。本文從CD4+CD25+Tregs角度出發(fā)，研究扶正抑瘤方對(duì)CD4+CD25+Tregs數(shù)量和功能的影響，進(jìn)一步探明該方調(diào)節(jié)腫瘤機(jī)體免疫功能的作用機(jī)制，對(duì)提高我國(guó)肝癌的治療水平有重要的社會(huì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 黃芪、靈芝、女貞子、淮山購(gòu)于福建同春藥業(yè)有限公司，經(jīng)中藥鑒定教研室鑒定后，按照2211的質(zhì)量配比, 加入適量生理鹽水浸泡，文火煎煮2次取濾液。按照動(dòng)物與人體間等效劑量公式[3]換算20 g小鼠的給藥劑量為18 g·kg-1·d-1。

1.2 試劑和儀器 小鼠PE-Cy5 rat anti-mouse CD3、PE rat anti-mouse CD4、FITC rat anti-mouse CD8、APC rat anti-mouse CD25(美國(guó)BD公司)；叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box p3, Foxp3)和誘導(dǎo)的T細(xì)胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator, ICOS)抗體及二抗(美國(guó)ABclonal公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；NC膜(美國(guó)Millipore公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；垂直電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 24只SPF級(jí)雄性6周齡、體質(zhì)量16～18 g的BALB/c小鼠購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司(合格證號(hào)：2013001815382)；小鼠肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，采用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 建立小鼠肝癌原位模型并分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22肝癌細(xì)胞接種到BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)并傳代，將傳代3次后的腹水小鼠做為瘤源動(dòng)物。抽取腹水，調(diào)整濃度為2×107·mL-1，接種于小鼠皮下，每只100 μL，待成瘤后將瘤體剪成0.5 mm3大小，植入小鼠肝左葉，建立小鼠肝癌原位模型。將模型小鼠隨機(jī)分為2組：模型組和藥物組，其中藥物組灌胃扶正抑瘤方18 g·kg-1·d-1，模型組灌胃等體積生理鹽水?？瞻捉M不造模，灌胃等體積生理鹽水。每組8只，連續(xù)給藥2周，并監(jiān)測(cè)小鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量變化情況。2周后眼球摘除取血，肝素鈉抗凝，檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+Tregs的百分比；游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體大小，并計(jì)算抑瘤率。瘤體大小的計(jì)算公式：體積=(短徑2×長(zhǎng)徑)/2；抑瘤率的計(jì)算公式：抑瘤率(%)=(模型組平均腫瘤體積-給藥組平均腫瘤體積)/模型組平均腫瘤體積×100%。

1.5 外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+Tregs檢測(cè) EDTA抗凝小鼠血100 μL，加入PE-Cy5 免抗鼠CD3、PE免抗鼠CD4、FITC免抗鼠CD8和APC免抗鼠CD25各10 μL，充分混勻，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各T淋巴細(xì)胞亞群含量。1.6 HE染色 將腫瘤組織固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液24 h，石蠟包埋、脫水、切片，HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。

1.7 Western blot檢測(cè)腫瘤組織中ICOS、Foxp3蛋白 提取細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉后放入ICOS、Foxp3一抗稀釋液中4 ℃下孵育過(guò)夜，再將膜放入二抗稀釋液室溫下繼續(xù)孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯色，拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況檢查 給藥期間3組小鼠均無(wú)死亡，體質(zhì)量和進(jìn)食量亦無(wú)顯著性差異。解剖后模型組中有4只小鼠出現(xiàn)血性腹水，藥物組有2只出現(xiàn)血性腹水。

2.2 肝臟大體觀及病理檢查 模型組和藥物組的肝左葉均有明顯凸起的白色腫塊，成瘤率100%。模型組中有4只小鼠肝臟呈現(xiàn)灰白色，質(zhì)地硬；藥物組小鼠肝臟顏色趨于正常。HE染色可見(jiàn)空白組肝細(xì)胞形態(tài)均一，以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列；模型組則見(jiàn)大小不一、形態(tài)各異、核異型性明顯的細(xì)胞呈團(tuán)塊聚集或彌漫散在分布，周圍血管豐富，中心可見(jiàn)壞死區(qū)?？梢?jiàn)肝癌原位模型建立成功。見(jiàn)圖1。

圖1 正常肝組織(A)和肝癌組織(B)鏡下圖片(HE，×400)

2.3 各組瘤體大小的比較 模型組的瘤體體積明顯大于藥物組(P<0.05)，抑瘤率達(dá)62.56%。見(jiàn)表1。

表1 2組腫瘤體積比較

2.4 各組T淋巴細(xì)胞亞群的比較 模型組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞較空白組明顯減低(P分別為0.005、0.003)，CD4+CD25+Tregs較空白組明顯升高(P<0.001)。給藥后CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞明顯升高(P分別為0.039、0.049)，CD4+CD25+Tregs明顯下降(P=0.001)。見(jiàn)表2。

2.5 2組ICOS和FOXP3蛋白表達(dá)的比較 藥物組ICOS和Foxp3的蛋白表達(dá)較模型組明顯減低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

表2 各組T淋巴細(xì)胞亞群的比較

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

圖2 2組肝癌組織ICOS、Foxp3蛋白表達(dá)的比較

組別ICOSFoxp3模型組0.73±0.100.89±0.12藥物組0.56±0.270.58±0.03t2.743.50P0.0500.025

3 討論

扶正抑瘤方以黃芪為君，益氣升陽(yáng)、固表止汗；以靈芝為臣，益精血、扶正氣，輔佐君藥增強(qiáng)療效；女貞、山藥同為佐使，滋補(bǔ)肝腎、健脾養(yǎng)陰。四藥相合，健脾補(bǔ)肺滋腎養(yǎng)肝，補(bǔ)虛損不忘健脾氣，先后天之本并補(bǔ)，提高正氣御邪之力。研究[2-3]表明，手術(shù)后聯(lián)合扶正抑瘤方治療肝癌患者，其累計(jì)生存率和24個(gè)月的復(fù)發(fā)率均優(yōu)于單純手術(shù)組，NK細(xì)胞活性及CD4+/CD8+的比值也較單純手術(shù)組有明顯升高，可見(jiàn)扶正抑瘤方可顯著升高肝癌患者的細(xì)胞免疫功能，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)扶正抑瘤方能顯著提高荷瘤小鼠化療后CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，明顯提高外周血NK細(xì)胞的百分比及細(xì)胞因子IL-2及TNF-α的表達(dá)水平[4]。本文研究發(fā)現(xiàn)，扶正抑瘤方顯著提高原位肝癌小鼠機(jī)體CD3+和CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，抑制移植瘤體生長(zhǎng)，這與我們之前對(duì)皮下肝癌移植瘤小鼠的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步明確扶正抑瘤方具有提高肝癌機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用。

CD4+CD25+Tregs是一類具有免疫抑制和免疫無(wú)能的T淋巴細(xì)胞亞群。在腫瘤微環(huán)境中，其能夠分泌IL-10和TGF-β等免疫抑制因子，抑制IL-2的產(chǎn)生，下調(diào)MHC Ⅱ類分子的表達(dá)，降低抗原特異性T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答[5]，降低樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原遞呈能力[6]；還可以通過(guò)表達(dá)顆粒酶B、穿孔素等物質(zhì)溶解自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞[7]?？梢?jiàn)CD4+CD25+Tregs影響了腫瘤微環(huán)境中多種免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性。目前已證實(shí)CD4+CD25+Tregs在多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部都明顯增多，如結(jié)直腸癌[8-9]、胃癌[10]、胰腺癌[11]、肝癌[12]等，其數(shù)量的增多預(yù)示著患者的預(yù)后不佳。因此清除腫瘤患者體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的數(shù)量成為腫瘤免疫治療的新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)原位肝癌小鼠外周血中CD4+CD25+Tregs含量較正常小鼠明顯增加，提示肝癌小鼠的機(jī)體免疫處于抑制狀態(tài)，而扶正抑瘤方能顯著降低原位肝癌小鼠外周血中CD4+CD25+Tregs的含量，可見(jiàn)扶正抑瘤方有清除CD4+CD25+Tregs的數(shù)量，提高肝癌機(jī)體免疫的作用。

然而研究[13]發(fā)現(xiàn)減低CD4+CD25+Tregs的數(shù)量對(duì)增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤活性的作用是短暫的，解除對(duì)CD4+CD25+Tregs的調(diào)控后，其數(shù)量很快又會(huì)恢復(fù)，因此在清除CD4+CD25+Tregs數(shù)量的同時(shí)還應(yīng)封閉CD4+CD25+Tregs的功能，降低其免疫抑制活性。Foxp3是CD4+CD25+Tregs的特異性標(biāo)志物，對(duì)CD4+CD25+Tregs的發(fā)育和功能起決定性調(diào)控作用[14]。而ICOS是CD4+CD25+Tregs表面參與腫瘤免疫逃逸的重要分子之一。有研究[15]表明，腫瘤微環(huán)境中的CD4+CD25+Tregs高表達(dá)ICOS分子，而高表達(dá)ICOS的CD4+CD25+Tregs比低表達(dá)ICOS的CD4+CD25+Tregs更具有免疫抑制活性。因此檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Foxp3和ICOS表達(dá)水平，可以考察扶正抑瘤方對(duì)CD4+CD25+Tregs功能的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤方下調(diào)了腫瘤組織Foxp3和ICOS的蛋白水平，提示扶正抑瘤方可能具有下調(diào)CD4+CD25+Tregs免疫抑制活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫效應(yīng)的作用。

綜上所述，扶正抑瘤方不僅減低了原位肝癌小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的數(shù)量，還封閉了其免疫抑制功能，這可是其提高原位肝癌小鼠細(xì)胞免疫功能的原因之一。

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