郜娜娜，賀新愛，馬 馨，許林平

(1.焦作市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 焦作 454000；2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 科研外事辦公室，河南 鄭州 450008)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。在許多國(guó)家和地區(qū)肺癌發(fā)病率、死亡率都已上升為惡性腫瘤的首位[1-2]。C-MYC蛋白是最早發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞增殖活性相關(guān)的原癌基因產(chǎn)物之一，在人類許多腫瘤中高表達(dá)[3]。C-MYC蛋白本身并不會(huì)發(fā)生同源二聚作用，也不結(jié)合DNA，但其能夠與Max形成異源二聚體，能與DNA上的E-box結(jié)合，進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞分化和凋亡等改變[4-6]。而MXI1是C-MYC的拮抗蛋白，一般來講，MYC/Max和MXI1/Max二聚體的比例決定基因啟動(dòng)子的活性，如以MYC/Max二聚體占主導(dǎo)，則主要表現(xiàn)為刺激細(xì)胞增殖；如以MXI1/Max二聚體占主導(dǎo)，則主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化[7]。本研究擬通過檢測(cè)晚期肺腺癌組織中C-MYC和MXI1的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)兩者表達(dá)狀況與臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生存狀況分析，旨在初步探討C-MYC和MXI1在晚期肺腺癌患者治療預(yù)后評(píng)估中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取焦作市第二人民醫(yī)院病理科2011年1月至2013年1月收治的100例晚期肺腺癌病變標(biāo)本，其中男72例，女28例；年齡35～73歲，中位年齡55歲。見表1。

表1 100例晚期肺腺癌患者基本資料

1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)方法 C-MYC兔抗人多克隆抗體和MXI1兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，工作濃度為1200；免疫組化S-P通用試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟后用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2室溫下孵育20 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，分別加入C-MYC抗體和MXI1抗體4 ℃孵育過夜，再分別加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素37 ℃孵育30 min，最后用DAB顯色，蘇木精對(duì)比顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。各步驟之間每次均用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 C-MYC和MXI1均以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。于顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的不同區(qū)域，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷每個(gè)視野的結(jié)果[8-9]。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：≤10%，0分；>10%～25%，1分；>25%～50%，2分；>50%～75%，3分；>75%，4分。染色強(qiáng)度分類：未著色，0分；淡黃色1分；黃色或深黃色，2分；褐或棕褐色，3分。兩者計(jì)分相乘得到該視野的最終得分。最后該切片根據(jù)得分分為以下4個(gè)等級(jí)：0～1分(-)、2～4分(+)、5～7分(++)、≥8分(+++)。(-)為陰性，(+)為弱陽(yáng)性表達(dá)，(++)、(+++)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，后兩者均記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，統(tǒng)計(jì)分析用χ2檢驗(yàn)；蛋白表達(dá)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)；生存分析用Kaplan-Meier法，2組之間生存時(shí)間比較用log rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 C-MYC和MXI1蛋白在晚期肺腺癌組織中的表達(dá) C-MYC和MXI1陽(yáng)性表達(dá)均主要位于細(xì)胞漿，部分位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。晚期肺腺癌組織中C-MYC和MXI1陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.00%(60/100)和55.00%(55/100)。見圖1。

2.2 晚期肺腺癌組織中C-MYC蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 C-MYC蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、ECOG評(píng)分、吸煙狀態(tài)、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA125、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比例均無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表2。

圖1 C-MYC(A)和MXI1(B)在晚期肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況(IHC，×400)

n(%)

2.3 晚期肺腺癌組織中MXI1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 MXI1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、ECOG評(píng)分、吸煙狀態(tài)、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA125、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比例均無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表3。

表3 MXI1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 n(%)

2.4 晚期肺腺癌組織中C-MYC和MXI1表達(dá)的相關(guān)性 在100例晚期肺腺癌組織中，C-MYC和MXI1同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性者24例，同時(shí)表達(dá)陰性者16例，C-MYC陽(yáng)性而MXI1陰性者28例，C-MYC陰性而MXI1陽(yáng)性者32例，Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示C-MYC、MXI1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.206，P<0.05)。見表4。

表4 晚期肺腺癌組織中C-MYC和MXI1表達(dá)的相關(guān)性 n

2.5 晚期肺腺癌患者C-MYC、MXI1表達(dá)與其中位生存時(shí)間的關(guān)系 應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)100例晚期肺腺癌患者進(jìn)行生存分析，所有患者的中位生存時(shí)間是19.11個(gè)月，應(yīng)用log rank法對(duì)2組之間患者進(jìn)行生存時(shí)間比較，結(jié)果顯示C-MYC陰性患者比C-MYC陽(yáng)性患者具有較長(zhǎng)的生存時(shí)間(21.00個(gè)月vs15.00個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.890，P=0.001)；而MXI1陽(yáng)性患者比MXI1陰性組的患者具有較長(zhǎng)的生存時(shí)間(21.00個(gè)月vs13.00個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.080，P=0.001)。見圖2、3。

圖2 C-MYC陽(yáng)性患者和C-MYC陰性患者生存時(shí)間比較

圖3 MXI1陽(yáng)性患者和MXI1陰性患者生存時(shí)間比較

3 討論

C-MYC蛋白是最早發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞增殖活性相關(guān)的原癌基因產(chǎn)物之一，在人類許多腫瘤中高度表達(dá)[3]。C-MYC蛋白是一種多功能蛋白，有廣泛的生物學(xué)功能，一方面參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，另一方面亦能啟動(dòng)凋亡和衰老程序[10]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在晚期肺腺癌組織中C-MYC陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%，且其表達(dá)與患者的臨床病理特征無明顯關(guān)系，提示C-MYC表達(dá)在晚期肺腺癌中是普遍的現(xiàn)象。我們進(jìn)一步對(duì)100例晚期肺腺癌患者進(jìn)行了生存分析，所有患者的中位生存時(shí)間是19.11個(gè)月，應(yīng)用log rank法對(duì)2組患者進(jìn)行生存時(shí)間比較，結(jié)果顯示C-MYC陰性患者比C-MYC陽(yáng)性患者具有較長(zhǎng)的生存時(shí)間。這可以直接說明C-MYC高表達(dá)可以影響患者的生存時(shí)間。從而可以說明C-MYC蛋白的高表達(dá)可能對(duì)晚期肺腺癌的預(yù)后有一定的影響，C-MYC可以作為晚期肺腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志。而Mad(包括MXI1、MAD1等)是C-MYC的拮抗蛋白，一般來講，MYC/Max和MAD/Max二聚體的比例決定基因啟動(dòng)子的活性，如以MYC/Max二聚體占主導(dǎo)，則主要表現(xiàn)為刺激細(xì)胞增殖，如以MAD/Max二聚體占主導(dǎo)，則主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在晚期肺腺癌組織中MXI1陽(yáng)性表達(dá)率為55.00%，且其表達(dá)與患者的臨床病理特征無明顯關(guān)系，提示MXI1的表達(dá)亦在晚期肺腺癌中是普遍的現(xiàn)象。同樣應(yīng)用log rank法對(duì)2組之間患者進(jìn)行生存時(shí)間比較，結(jié)果顯示MXI1陽(yáng)性患者比MXI1陰性患者具有較長(zhǎng)的生存時(shí)間。這可以直接說明MXI1低表達(dá)可以影響患者的生存時(shí)間。從而可以說明MXI1蛋白的低表達(dá)可能對(duì)晚期肺腺癌的預(yù)后有一定的影響，MXI1可以作為晚期肺腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志。

本組數(shù)據(jù)顯示C-MYC高表達(dá)的患者、MXI1低表達(dá)的患者預(yù)后較差，提示2種蛋白存在相關(guān)性，我們通過Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示C-MYC、MXI1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這可能是癌基因C-MYC高表達(dá)和抑癌基因MXI1的低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等，從而促進(jìn)晚期肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展，影響了晚期肺腺癌患者的預(yù)后。我們前期的研究亦發(fā)現(xiàn)C-MYC和MXI1的異常表達(dá)與乳腺癌患者的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)行了本研究，且研究結(jié)果相同，提示兩者的異常表達(dá)在晚期肺腺癌患者的發(fā)生和演化中起到重要作用，為晚期肺腺癌的預(yù)后評(píng)估提供了新的指標(biāo)。

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