黎 醉，高 陽，趙 波，牟 毅，儲張杰

（浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus屬鯉形目，鰍科，副泥鰍屬，具有營養(yǎng)價(jià)值高、生長速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和市場價(jià)值高等特點(diǎn)，已成為最具潛力的養(yǎng)殖品種之一，養(yǎng)殖規(guī)模也以極快的速度發(fā)展。在我國除青藏高原外，湖泊、水庫、稻田、溝渠均有養(yǎng)殖。目前，我國稻田養(yǎng)殖每畝可產(chǎn)泥鰍340～450 kg[1]。

硒是動(dòng)物正常生長所必需的營養(yǎng)元素，在動(dòng)物抗氧化和細(xì)胞代謝方面具有重要作用[2]。在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中硒的添加方式主要有兩種，一種是在日糧中添加亞硒酸鈉[3]，另一種是以酵母硒（Se-Cys）或者硒代蛋氨酸（SelMet）的有機(jī)形式添加[4]。無機(jī)硒在使用過程中利用率低、毒性大并且殘余的無機(jī)硒會(huì)對環(huán)境造成污染[5]。而有機(jī)硒，如富硒酵母，作為日糧添加劑具有效率高，污染小等優(yōu)點(diǎn)，但硒含量低，制備工藝復(fù)雜，且費(fèi)用高[6]。殼聚糖是一種來源于甲殼的陽離子多糖，是甲殼綱動(dòng)物和昆蟲的外骨骼中廣泛存在的N-乙酰葡萄糖胺天然聚合物[7-8]。殼聚糖能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長，提高抗疾病能力[9]。許多研究表明，殼聚糖具有多種生物功能，例如抗腫瘤活性、免疫增強(qiáng)活性、降血脂活性和凝血因子活性[10-11]。殼聚糖結(jié)構(gòu)中的N和O能結(jié)合金屬離子和活性物質(zhì)。因此通過化學(xué)合成，可將殼聚糖與無機(jī)硒—亞硒酸鈉合成硒化殼聚糖。

硒化殼聚糖的潛在免疫刺激作用，已在家禽及貝類的許多研究中被證實(shí)[12]。而在水產(chǎn)動(dòng)物應(yīng)用中也有發(fā)現(xiàn)，硒化殼聚糖可提高櫛孔扇貝Chlamys farreri的免疫能力[3,13]。但至今為止，有關(guān)硒化殼聚糖對魚類抗氧化能力的影響研究還很少。魚類抗氧化能力是魚類免疫功能的一個(gè)重要方面，主要與魚體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等活性以及丙二醛（MDA）含量密切相關(guān)。鑒于此，本文主要研究硒化殼聚糖作為飼料添加劑對泥鰍抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用魚來自舟山市臺島鰍業(yè)有限公司，起始平均體質(zhì)量為4.9±0.2 g。

1.1.2 飼料組成

本次實(shí)驗(yàn)所用硒化殼聚糖為浙江海洋大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成。對照組的泥鰍飼喂基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組飼料在基礎(chǔ)飼料中添加了0.3%、0.6%、0.9%和1.2%硒化殼聚糖，兩組飼料均為浮性顆粒飼料?；A(chǔ)飼料營養(yǎng)水平按照我們之前實(shí)驗(yàn)中的飼料配方，即磷酸二氫鈣1.8%、維生素預(yù)混料0.12%、小麥麩皮7%、菜籽餅4%、花生油2%、魚粉22%、豆粕35%、玉米17%、微量元素預(yù)混合飼料0.08%、羧甲基維生素納1%、麥飯10%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)開始前，挑選1 000尾大小規(guī)格基本一致的泥鰍暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室300 L的水桶中。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，選取450尾體質(zhì)健壯、規(guī)格相近的泥鰍隨機(jī)放養(yǎng)到15個(gè)容積為20 L的水族箱中，分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)組中30尾泥鰍。注入的水為充氧曝氣自來水，使用4個(gè)12 W四孔充氧機(jī)24 h不間斷充氧。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程水溫控制在24±1℃，氨氮和亞硝酸鹽濃度分別控制在0.06 mg/L和0.02 mg/L以下，pH 7.1，溶氧保持在5.0～6.0 mg/L，每天換水1/3。每天投喂2次（早上8:00和下午6:00），每次投喂量占泥鰍體重的5%～7%，每次投喂1 h后清除殘餌和糞便，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為60 d。

飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)，停喂24 h后取樣，每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)取10尾魚用MS-222（Sigma-Aldrich）麻醉，魚體表面用70%乙醇進(jìn)行消毒，然后用手術(shù)刀將泥鰍的肝臟快速剖出稱重，放于冰塊上切碎，在-80°C冰箱保存。分析時(shí)，在低溫條件下，用10倍的冰凍去離子水制成勻漿，再用離心機(jī)在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，獲得上清液，測定CAT、GPX、SOD、MDA、T-AOC。測定采用上海常斤生物科技有限公司的酶試劑盒，方法按照說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey方差檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

泥鰍肝臟CAT活性隨著硒化殼聚糖濃度的升高而增加（圖1）。當(dāng)硒化殼聚糖濃度高于0.6%時(shí)，CAT活性顯著高于空白組和0.3%添加組（P＜0.05），而空白組和0.3%添加組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。從圖2中可以看出各實(shí)驗(yàn)組的GPX活性均顯著高于空白組（P＜0.05），而各實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著差異（P＞0.05）；從圖3中可以看出SOD活性在0.3%添加水平與空白組差異不顯著（P＞0.05），但當(dāng)硒化殼聚糖的添加水平高于0.3%時(shí)，SOD活性均顯著高于空白組（P＜0.05），并在硒化殼聚糖濃度為1.2%時(shí)達(dá)到最高值，并顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；從圖4中可看出，MDA含量隨硒化殼聚糖含量的增加而呈明顯下降趨勢（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組MDA含量均顯著低于對照組（P＜0.05），且在硒化殼聚糖濃度為1.2%時(shí)達(dá)到實(shí)驗(yàn)最低值；最后，從圖5中可以看出實(shí)驗(yàn)組的TAOC明顯高于空白組（P＜0.05），并在0.9%和1.2%添加水平時(shí)顯著高于0.3%和0.6%添加水平（P＜0.05）。

圖1 硒化殼聚糖對泥鰍肝臟過氧化氫酶（CAT）活性的影響Fig.1 Effect of seleno-chitosan on catalase activity of loach

圖2 硒化殼聚糖對泥鰍肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性的影響Fig.2 Effect of seleno-chitosan on glutathione peroxidase activity of loach

圖3 硒化殼聚糖對泥鰍肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響Fig.3 Effect of seleno-chitosan on superoxide dismutase activity of loach

圖4 硒化殼聚糖對泥鰍肝臟丙二醛（MDA）含量的影響Fig.4 Effect of seleno-chitosan on the malonicdialdehyde content of loach

圖5 硒化殼聚糖對泥鰍肝臟總抗氧化活性（T-AOC）的影響Fig.5 Effect of seleno-chitosan on total antioxidant activity of loach

3 討論

硒是人體所必需的微量元素，具有抗腫瘤等多方面的功能[14-15]，多糖是一種廣譜的免疫增強(qiáng)劑，能夠增強(qiáng)人體的免疫功能[16]。多聚糖硒作為補(bǔ)硒劑具有良好的穩(wěn)定性和溶出性，而且在釋放出硒后，配合體多糖不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，同時(shí)還能促進(jìn)金屬離子的吸收和利用[17]。作為一種飼料添加劑，硒化殼聚糖已廣泛用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，如ARTHINGTON[18]研究表明，肉用閹牛日糧中添加硒時(shí)其血漿中谷胱甘肽過氧化物酶活性有明顯升高。在水產(chǎn)中關(guān)于硒化殼聚糖也有相關(guān)研究，如王宜艷等[13]在對櫛孔扇貝血細(xì)胞的研究中已證實(shí)硒化殼聚糖可顯著的提高櫛孔扇貝中血細(xì)胞中參與抗氧化的CAT活性。因此，利用有機(jī)硒或者硒多糖來提高養(yǎng)殖動(dòng)物的抵抗能力來達(dá)到防御疾病的效果，越來越得到養(yǎng)殖研究者的重視。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)硒化殼聚糖顯著提高了泥鰍的抗氧化能力，尤其是在硒化殼聚糖濃度達(dá)到0.9%時(shí)，抗氧化能力達(dá)到最高。

泥鰍的抗氧化能力與體內(nèi)的SOD、CAT、GPX活性以及MDA含量密切相關(guān)。本研究中，泥鰍肝臟的GPX活性與硒化殼聚糖濃度呈高度正相關(guān)。ROTRUCK，et al[19]研究表明硒作為GPX的重要組成部分，硒的添加可提高GPX的活性。酶活性的提高可增強(qiáng)清除自由基的能力，保護(hù)機(jī)體組織免受氧化損傷。過氧化物是機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的廢物，對機(jī)體內(nèi)的器官會(huì)造成損害。而CAT是一種催化過氧化氫分解為氧和水的酶，在抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。從本研究結(jié)果的圖1中可以看出CAT的活性隨硒化殼聚糖濃度的增加而提高。GPX與CAT的作用相似，因此，GPX含量的多少，也可用于衡量機(jī)體抗氧化能力大小[20]。在對虹鱒Oncorhynchus mykiss[21]、斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus[22]、皺紋盤鮑Haliotis discus hannai[23]和點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus malabaricus[24]的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著硒在動(dòng)物體內(nèi)的積累，GPX的活性顯著提高，這與本研究結(jié)果一致，即泥鰍GPX的活性隨硒化殼聚糖的濃度的增加而增加。SOD是機(jī)體抗氧化體系中的重要成員，與GPX協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，阻止氧自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所以，SOD的活性可以相對的反映出硒在體內(nèi)清除自由基的程度[25]。但是在圖3中，硒化殼聚糖對SOD活性的影響呈波浪式。徐輝碧等[26]報(bào)道當(dāng)硒超出一定濃度范圍時(shí)，活性氧自由基數(shù)量隨硒的濃度增大而增多，表現(xiàn)為生物毒性作用。在0.3%時(shí)，SOD的活性并沒有得到明顯改善，在高于0.3%時(shí)酶活有所明顯改善,說明硒化殼聚糖對SOD的促進(jìn)作用只在一定范圍內(nèi)。

MDA是機(jī)體不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量變化是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，可反映機(jī)體的氧化損傷程度[27]。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MDA含量隨著硒化殼聚糖濃度的增加整體呈現(xiàn)下降趨勢，說明硒化殼聚糖對MDA具有抑制作用。蘇傳福[28]研究發(fā)現(xiàn)日糧硒含量為0.66 mg/kg時(shí)可以顯著降低草魚Ctenopharyngodon idellus幼魚肝臟和血清的MDA含量，有效的抵抗氧化損壞。總抗氧化能力可反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)以及機(jī)體自由基代謝狀況，是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的一個(gè)綜合指標(biāo)[29]。楊凡等[30]的研究表示，水生動(dòng)物飼料中添加酵母硒顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的總抗氧化能力。蘇傳福[28]在草魚幼魚中添加硒發(fā)現(xiàn)草魚總抗氧化能力明顯提升。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，添加硒化殼聚糖可以提高泥鰍的總抗氧化能力，可能是因?yàn)槲瘹ぞ厶翘岣吡薙OD、CAT和GPX等酶的活性。但是硒化殼聚糖的濃度在1.2%時(shí)，出現(xiàn)下降的趨勢，可能由于高濃度的硒所表現(xiàn)出的毒性所致。

目前國內(nèi)對水生動(dòng)物日糧中添加硒化殼聚糖的研究較少，但在酵母硒的添加應(yīng)用上有不少研究。曹丹等[31]在酵母硒添加對暗紋東方鲀Takifugu obscurus生長的研究中發(fā)現(xiàn)，添加了酵母硒的試驗(yàn)組的生長基本高于對照組。常仁亮等[32]使用酵母硒替代部分魚粉用于中國對蝦Fenneropenaeus chinensis養(yǎng)殖，結(jié)果顯示含酵母硒的實(shí)驗(yàn)組的養(yǎng)殖效果高于對照組。在王井亮等[33]、徐有卿等[34]的研究中都顯示了相似的結(jié)果。從這些研究中可以推出在飼料中添加硒化殼聚糖對泥鰍的養(yǎng)殖不僅不會(huì)產(chǎn)生副作用，還會(huì)促進(jìn)泥鰍的生長，提高養(yǎng)殖泥鰍的品質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)中，硒化殼聚糖的添加能夠增強(qiáng)CAT、GPX和SOD的活性，減少M(fèi)DA含量，提高總抗氧化能力，從而增強(qiáng)泥鰍的免疫力，促進(jìn)了泥鰍的健康生長。已有研究表明[35]，無機(jī)硒在動(dòng)物肝臟中是被動(dòng)吸收的，而硒蛋白氨基酸等有機(jī)硒是主動(dòng)吸收的。根據(jù)這些研究結(jié)果，我們推測硒化殼聚糖類似于多糖，這樣更有利于被吸收，具有較高的生物利用率，故排泄物中含硒量少，有利于減少污染，保護(hù)環(huán)境，前景更廣闊。

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