孫昕皓，金晴昊，夏亞男，符志楊，綦宇軒，曲有樂(lè)，關(guān)麗萍

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

抑郁癥是一種典型的精神疾病。抑郁癥患者主要表現(xiàn)為心情沉重，對(duì)工作生活喪失興趣，精神疲乏，對(duì)生活瑣事力不從心，生活態(tài)度悲觀消極，內(nèi)心痛苦，常感到絕望，嚴(yán)重影響了他們?nèi)粘５墓ぷ髋c生活，也給家人及社會(huì)帶來(lái)了一定的負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO預(yù)測(cè)到2020年，抑郁癥將成為威脅人類生命健康的第二大殺手[1-3]。

研究表明，抑郁可能與體內(nèi)的炎癥和疼痛有關(guān)，炎癥和神經(jīng)性疼痛都可能誘導(dǎo)患者罹患抑郁癥，而且重度抑郁患者會(huì)出現(xiàn)疼痛和炎癥加重的現(xiàn)象。MAES，et al[4]發(fā)現(xiàn)重癥抑郁癥患者的機(jī)體，處于血漿陽(yáng)性急性期蛋白升高和陰性急性期蛋白降低的炎性狀態(tài)，體內(nèi)所感染的炎癥的發(fā)生，通過(guò)腦內(nèi)的細(xì)胞介質(zhì)IL-1使得動(dòng)物和人體表現(xiàn)出厭食發(fā)熱、活動(dòng)減少、情緒低沉等“病態(tài)行為”。CAPURON，et al[5]研究表明，周圍炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)患者神經(jīng)病理性疼痛和抑郁合并癥。用IFN-α給丙型肝炎或惡性黑色素瘤患者給予系統(tǒng)性治療后，患者出現(xiàn)抑郁癥狀的，其中45%的患者可發(fā)展成重度抑郁障礙。

慢性應(yīng)激是慢性疼痛的一種顯著性特點(diǎn)，人腦中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和NA的釋放紊亂程度也與疼痛應(yīng)激持續(xù)的時(shí)間和力度有關(guān)，而5-HT及NA在腦中含量的降低可導(dǎo)致抑郁樣癥狀。BAIR，et al[6]研究表明，30%～60%的慢性疼痛患者臨床伴有抑郁癥狀。抑郁癥患者也表現(xiàn)出體內(nèi)慢性疼痛的臨床癥狀（頭痛、背痛等）。MILLER，et al[7]研究表明，慢性疼痛患者經(jīng)由影像學(xué)可檢測(cè)到其藍(lán)斑結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能趨使疼痛患者出現(xiàn)焦慮、悲觀痛苦、情緒低沉的抑郁樣行為，并且與疼痛本身引發(fā)的厭惡情緒相比，這種長(zhǎng)期應(yīng)激于神經(jīng)病理性疼痛而誘導(dǎo)出的抑郁表征更為明顯。

近年來(lái)，有關(guān)黃酮類化合物的抗抑郁作用陸續(xù)有了研究報(bào)道。如鄭莉等[8]從貫葉金絲桃中分離得到的槲皮苷，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芤种茊伟费趸窤的活性，具有潛在的抗抑郁作用。王衛(wèi)星等[9]認(rèn)為金絲桃苷等10個(gè)天然黃酮類化合物的具有不同程度的縮短小鼠強(qiáng)迫游泳時(shí)間，顯示不同程度抗抑郁活性。龔乃超等[10]發(fā)現(xiàn)從魚腥草中提取的黃酮物質(zhì)抗抑郁效果優(yōu)于抗抑郁藥氯丙咪嗪。

課題組研究發(fā)現(xiàn)二氫黃酮化合物GSUN-703（其結(jié)構(gòu)如圖1）（10 mg/kg劑量）能顯著抑制小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，顯示一定的抗抑郁活性。本研究對(duì)化合物GSUN-1601采用經(jīng)典抗抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)”和“小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行不同劑量研究，同時(shí)，對(duì)化合物進(jìn)行抗炎和抗鎮(zhèn)痛研究，以期探討抗抑郁與炎癥和疼痛之前的關(guān)系，初步探討其作用機(jī)制，為抗抑郁的研究提供理論依據(jù)。

圖1 二氫黃酮化合物GSUN-703結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compound GSUN-703

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)T-IR1730紅外光譜儀（Bruker公司），AV-300核磁共振光譜儀（Bruker公司），HP1100LC/MS質(zhì)譜儀（美國(guó)惠普公司），BS323S精密天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。氟西汀，吲哚美辛，2，4-二羥基苯乙酮，2，4-二氯苯甲醛，無(wú)水乙酸鈉購(gòu)自Sigma公司。其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠（ICR）20±2 g，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校。

1.3 GSUN-703的合成路線

反應(yīng)條件：

（i）prenyl bromide,anhydrous K2CO3;（ii）aromatic aldehyde,KOH;（iii）EtOONa.

1.3.1 2-羥基-4-異戊烯氧基苯乙酮的制備

在100 mL圓底燒瓶中分別加入2，4-二羥基苯乙酮0.50 g，0.95 g無(wú)水碳酸鉀，40 mL無(wú)水丙酮，50℃下反應(yīng)1 h。緩慢滴加入溴代異戊烯（0.64 g加入2 mL無(wú)水丙酮中），回流3 h。TLC跟蹤反應(yīng)直至原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。濾除碳酸鉀，并用丙酮淋洗。合并濾液，蒸除丙酮，以石油醚/乙酸乙酯=20:1柱層析，得白色固體。

1.3.2 2-羥基-4-異戊烯氧基-2′，4′-二氯查爾酮的制備

在100 mL圓底燒瓶中加入2-羥基-4-異戊烯氧基苯乙酮0.50 g，2,4-二氯苯甲醛0.5 g，在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下，邊攪拌邊滴加由4.90 g KOH和44.0 mL無(wú)水乙醇配成的14%的KOH溶液，室溫?cái)嚢?0 h。TLC跟蹤反應(yīng)直至原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液傾倒入冰水中，用HCl調(diào)pH至中性，用乙醚萃取。合并乙醚層，蒸除乙醚，以石油醚/乙酸乙酯=20:1柱層析，得到黃色針狀晶體2-羥基-4-異戊烯氧基-2′，4′-二氯查爾酮[11-12]。

1.3.3 7-異戊烯氧基-2′，4′-二氯-2，3-二氫黃酮（GSUN-703）的制備

在圓底燒瓶中加入2-羥基-4-異戊烯氧基-2′，4′-二氯查爾酮0.50 g，無(wú)水乙酸鈉0.80 g及無(wú)水乙醇40 mL，回流10 h。蒸除乙醇，加水，用乙醚萃取。合并乙醚層，蒸除乙醚，石油醚/乙酸乙酯[V（石油醚）/V（乙酸乙酯）]=20:1柱層析，得白色固體二氫黃酮GSUN-703。

1.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）

雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)前正常飲水和進(jìn)食，隨機(jī)分組，每組8只。二氫黃酮GSUN-703溶解在DMSO中，以1，5和10 mg/kg劑量腹腔注射給藥，氟西?。?0 mg/kg）注射30 min后，將小白鼠單只放入高為20 cm，直徑為14 cm，水深為10 cm，溫度為（25±2℃）的圓柱形玻璃容器中，觀察6 min。記錄實(shí)驗(yàn)后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間（小鼠浮在水面上不動(dòng)或僅僅輕微劃動(dòng)肢體以確保頭部浮在水面上所花費(fèi)的時(shí)間為小鼠的不動(dòng)時(shí)間）[13]。采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）

將小鼠尾部距離尖端2 cm處用尾巴夾鉗固定，懸掛于支架上，頭部距離臺(tái)面5 cm。實(shí)驗(yàn)環(huán)境在黑暗，無(wú)明顯噪音。小鼠懸浮6 min，記錄后4 min的小鼠不動(dòng)的持續(xù)時(shí)間（小鼠的不動(dòng)時(shí)間為它們被懸掛后徹底靜止不動(dòng)的時(shí)間）[14-15]。采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 抗炎實(shí)驗(yàn)

二氫黃酮GSUN-703和吲哚美辛溶于聚乙二醇-200中，小鼠隨機(jī)分組，每組8只。給藥組分別以10 mg/kg劑量下腹腔注射給藥，按照0.1 mL/20 g。給藥0.5 h后，小鼠左耳內(nèi)外兩面涂抹二甲苯，用量為0.05 mL/20 g為實(shí)驗(yàn)組；右耳朵不涂抹，作為對(duì)照組[16-17]。炎癥造模15 min后，頸脫臼處死小鼠，使用小鼠耳打孔機(jī)中直徑6 mm的打孔模具分別在同一位置打下小鼠左右雙耳的耳片。記錄其質(zhì)量，計(jì)算腫脹度和腫脹率。以左右兩側(cè)耳片重量差作為腫脹程度的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腫脹程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組件比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抗炎作用強(qiáng)度以腫脹率（%）和腫脹抑制率（%）表示。

腫脹度=左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量；腫脹率=[（左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量）/左耳重量]×100%。

1.7 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

二氫黃酮GSUN-703和吲哚美辛溶于PEG-200中，以10 mg/kg劑量腹腔注射，小鼠隨機(jī)分組，每組8只。注射體積為0.1 mL/20 g。給藥30 min后，腹腔注射1.2%的冰乙酸生理鹽水[18]，注射劑量為0.2 mL/20 g，觀察15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體現(xiàn)象的次數(shù)。小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的現(xiàn)象為：四肢延伸，腹部收縮內(nèi)凹，臀部扭轉(zhuǎn)的一系列動(dòng)作。按照公式統(tǒng)計(jì)藥物在醋酸致痛模型中對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制率和鎮(zhèn)痛百分率。抑制率%=（空白組扭體次數(shù)均數(shù)-給藥組扭體次數(shù)均數(shù)）/空白組扭體反應(yīng)均數(shù)×100%；鎮(zhèn)痛百分率%=（給藥組無(wú)扭體反應(yīng)數(shù)-空白組無(wú)扭體反應(yīng)數(shù)）/空白組扭體反應(yīng)數(shù)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氫黃酮GSUN-703光譜數(shù)據(jù)

對(duì)目標(biāo)化合物采用IR、1H-NMR、13C-NMR和MS確定結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率和光譜數(shù)據(jù)為，產(chǎn)率 66.7%.1H-NMR（CDCl3,300 MHz）:1.66（s,3H,-CH3）,1.70（s,3H,-CH3）,2.71（d,2H,-CH2）,2.80（t,1H,-CH）,4.50（d,2H,-CH2）,5.41（t,1H,=CH）,6.40-6.57（m,3H,-C6H3）,7.30-7.71（m,3H,-C6H3）.13C-NMR（CDCl3,75 MHz）:18.3,25.8,42.9,65.3,76.2,101.7,111.0,114.5,118.8,127.9,128.6,129.3,132.2,134.6,135.5,138.8,160.9,163.1,165.5,189.3.IR （KBr）cm-1:2927,2915,1675,1446,1259,962.MS （M+1）:377.

2.2 GSUN-703抗抑郁活性

二氫黃酮GSUN-703小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，二氫黃酮GSUN-703能明顯的抑制小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，在3種劑量下（1、5和10 mg/kg）。其中，在10 mg/kg劑量下其抑制率為64.2%，與氟西汀抑制率相似（67.6%）。顯示一定的抗抑郁活性。

表1 GSUN-703小鼠強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.1 Evaluation of the antidepressant activity of GSUN-703 in the FST in mice

二氫黃酮GSUN-703小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，二氫黃酮GSUN-703能明顯的抑制小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，在3種劑量下（1，5和10 mg/kg）。其中，在10 mg/kg劑量下其抑制率為54.1%，與氟西汀抑制率相似（57.5%），顯示一定的抗抑郁活性。

表2 GSUN-703小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.2 Evaluation of the antidepressant activity of GSUN-703 in the TST in mice

2.3 GSUN-703抗炎、抗鎮(zhèn)痛活性

采用小鼠耳腫脹模型和醋酸致痛模型進(jìn)行小鼠的抗炎活性和鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物GSUN-703在10 mg/kg的給藥劑量下，與空白組相比具有顯著性差異（P＜0.01），顯示出一定的抗炎與鎮(zhèn)痛活性。化合物GSUN-703的抗炎率為77.5%，鎮(zhèn)痛率為70.4%。其抗炎鎮(zhèn)痛活性仍低于陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛。

表3 GSUN-703抗炎和止痛活性數(shù)據(jù)Tab.3 In vivo anti-inflammatory and analgesic activities of GSUN-703

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)被動(dòng)接受抑郁癥的兩個(gè)經(jīng)典的應(yīng)激模型，從而誘發(fā)動(dòng)物絕望的狀態(tài)，在小鼠中實(shí)驗(yàn)具有良好的可靠性和預(yù)測(cè)性。已知現(xiàn)在的多種抗抑郁藥可以在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)“行為絕望狀態(tài)”實(shí)驗(yàn)中減少小鼠的不動(dòng)時(shí)間[19-20]。

在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物GSUN-703在3種劑量下（1、5和10 mg/kg）顯著的抑制小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾的不動(dòng)時(shí)間，顯示一定的抗抑郁活性。其中，GSUN-703在10 mg/kg劑量下其抑制率為64.2%（FST）和抑制率為54.1%（TST），與氟西汀抑制率相似。另外，化合物GSUN-703在10 mg/kg的給藥劑量下，與空白組相比具有顯著性差異（P＜0.01），顯示出一定的抗炎與鎮(zhèn)痛活性。化合物GSUN-703的抗炎率為77.5%，鎮(zhèn)痛率為70.4%。推斷化合物GSUN-703的抗抑郁作用機(jī)制，可能是通過(guò)炎癥免疫假說(shuō)的細(xì)胞介質(zhì)傳導(dǎo)或與疼痛抑郁合并癥機(jī)制有關(guān)，起到抗抑郁療效。

3 結(jié)論

以市售的2，4-二羥基苯乙酮為起始原料，經(jīng)過(guò)Williamson反應(yīng)、克萊森—斯密特縮合、親核取代和Michael反應(yīng)，獲得目標(biāo)化合物二氫黃酮GSUN-703。對(duì)目標(biāo)化合物采用紅外光譜、核磁共振光譜和質(zhì)譜確定了其結(jié)構(gòu)。

采用經(jīng)典抗抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)”，對(duì)GSUN-703進(jìn)行抗抑郁活性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSUN-703小鼠腹腔注射1、5和10 mg/kg的給藥劑量下，能明顯的抑制小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾的不動(dòng)時(shí)間，顯示一定的抗抑郁活性。

采用小鼠耳朵涂抹二甲苯致炎模型和小鼠注射冰乙酸致疼痛模型，對(duì)GSUN-703進(jìn)行抗炎和鎮(zhèn)痛活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠腹腔注射10 mg/kg劑量的GSUN-703，與空白組相比具有顯著性差異（P＜0.01），顯示出一定的抗炎與鎮(zhèn)痛活性。此結(jié)果初步推斷二氫黃酮GSUN-703的抗抑郁作用機(jī)制，可能是通過(guò)炎癥免疫假說(shuō)的細(xì)胞介質(zhì)傳導(dǎo)或與疼痛抑郁合并癥機(jī)制有關(guān)。

[1]LOPEZ A D,MURRAY C C.The global burden of disease,1990-2020[J].Nat Med,1998,4（11）:1 241-1 243.

[2]GAFFREY M S,LUBY J L,BARCH D M.Towards the study of functional brain development in depression:Aninteractive specialization approach[J].Neurobiol Dis,2013,52:38-48.

[3]BERGNER C L,SMOLINSKY A N,HART P C,et al.Mouse models for studying depression-like states and antidepressant drugs[J].Methods Mol Biol,2016,1438:255-269.

[4]MAES M,VANDOOLAEGHE E,RANJAN R,et al.Increased serum interleukin-1-receptor antagonist concentrations in major depression[J].J Affect Disord,1995,36（1/2）:29-36.

[5]CAPURON L,RAVAUD A,NEVEU P J,et al.Association between decreased serum tryptophan concentrations and depressive symptoms in cancer patients undergoing cytokine therapy[J].Mol Psychiatry,2002,7（5）:468-473.

[6]BAIR M J,ROBINSON R L,KATON W,et al.Depression and pain comorbidity:a literature review[J].Arch Intern Med,2003,163（20）:2 433-2 445.

[7]MILLER A H,MALETIC V,RAISON C L.Inflammation and its discontents:the role of cytokines in the pathophysiology of major depression[J].Biol Psychiatry,2009,65（9）:732-741.

[8]鄭 莉,劉國(guó)卿.貫葉連翹提取物對(duì)單胺氧化酶與單胺遞質(zhì)的影響[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33（2）:138-141.

[9]王衛(wèi)星,胡新穎,劉 鵬,等.金絲桃苷等10個(gè)天然黃酮類化合物的抗抑郁活性篩選研究[J].中草藥,2007,38（6）:900-902.

[10]龔乃超,陳菁筠,劉 棗,等.魚腥草黃酮抗抑郁活性的研究[J].化學(xué)與生物工程,2009,26（3）:41-44.

[11]SUI Xin,QUAN Yingchun,CHANG Yue,et al.Synthesis and studies on antidepressant activity of 2′,4′,6′-trihydroxychalcone derivatives[J].Med Chem Res,2011,21（7）:1 290-1 296.

[12]ZHEN Xinghua,QUAN Yingchun,PENG Zhou,et al.Design,synthesis,and potential antidepressant-like activity of 7-prenyloxy-2,3-dihydroflavanone derivatives[J].Chem Biol Drug Des,2016,87（6）:858-866.

[13]PORSOLT R D,BERTIN A,JALFRE M.Behavioural despair in mice:a primary screening test for antidepressants[J].Arch Int Pharmacodyn Ther,1977,229（2）:327-336.

[14]STERU L,CHERMAT R,THIERRY B,et al.The tail suspension test:a new method for screening antidepressants in mice[J].Psychopharmacology （Berl）,1985,85（3）:367-370.

[15]RANE R A,NAPAHDE S,BANGALORE P K,et al.Synthesis and evaluation of novel marine bromopyrrole alkaloid-based derivatives as potential antidepressant agents[J].Chem Biol Drug Des,2014,84（5）:593-602.

[16]曹 雯,劉 歡,韓清娟,等.（E）-苯乙基-3-（3,5-二羥基-4-異丙基苯基）丙烯酸酯的抗炎作用及抗炎初步機(jī)制研究[J].免疫學(xué)雜志,2015,31（1）:12-16.

[17]于 紅,王 緋,欒 洋,等.5-芳基-1,2-二氫-1-吡咯里嗪酮類化合物的合成及抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2003,13（6）:335-338.

[18]莫 瓊.白芍對(duì)小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛效果及固有免疫分子機(jī)制研究[D].重慶:西南大學(xué),2015.

[19]KHIN P P,ZAW T S,SOHN U D.Signal transduction underlying the inhibitory mechanism of fluoxetine on electrical field stimulation response in rat lleal smooth muscle[J].Pharmacol,2017,99（5/6）:216-225.

[20]STRASBURGER S E,BHIMANI P M,KAABE J H,et al.What is the mechanism of Ketamine's rapid-onset antidepressant effect A concise overview of the surprisingly large number of possibilities[J].J Clin Pharm Ther,2017,42（2）:147-154.