鐘彤 楊雙強(qiáng)

SHOX2基因甲基化與肺癌

鐘彤 楊雙強(qiáng)

在全球范圍內(nèi)，肺癌是癌癥死亡的首要原因，肺癌死亡人數(shù)占癌癥死亡人數(shù)的20%[1]，目前肺癌相對(duì)五年生存率僅為18%[2]。改善肺癌的低生存率依耐于早期診斷及合理治療。目前已經(jīng)證明低劑量CT作為早期肺癌的篩查手段可以降低肺癌死亡率[3]，但假陽性率較高，因此，以無創(chuàng)或微創(chuàng)方式獲取的標(biāo)本檢測肺癌標(biāo)志物以輔助肺癌診斷及鑒別診斷，仍然具有很大價(jià)值。

近10多年來，DNA甲基化作為一種新型腫瘤標(biāo)志物得到了廣泛研究，涉及到眾多基因的甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，人矮小同源盒基因2(Short Stature Homeobox 2，SHOX2，又名OG12、SHOT、OG12X)基因甲基化可以在肺癌患者不同類型標(biāo)本中檢測到，作為肺癌標(biāo)志物用于肺癌診斷具有突出的敏感性和特異性。本文對(duì)近幾年來SHOX2 基因甲基與肺癌診斷、治療監(jiān)測及指示預(yù)后的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

一、SHOX2基因及其甲基化與肺癌的關(guān)系

SHOX2基因定位于3號(hào)染色體長臂(3q25.32),其長度為10kb，包含7個(gè)外顯子，SHOX2基因還包含兩個(gè)大的CpG島，一個(gè)位于5，端，長1kb，另一個(gè)位于3，端，長500bp。SHOX2基因?qū)儆谕春谢蚣易?，這一基因家族編碼的蛋白均含有一個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的模體，是一個(gè)DNA結(jié)合域。同源盒基因編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與脊椎動(dòng)物及無脊椎動(dòng)物的形態(tài)發(fā)生相關(guān)，有幾個(gè)人類遺傳性疾病是同源盒基因異常引起。SHOX2 基因在胚胎期表達(dá)于中胚層和外胚層，在骨骼和心臟發(fā)育中起重要作用，SHOX2 基因異常與先天性身材矮小相關(guān)[6-9]。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。DNA甲基化發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸中胞嘧啶的第5位碳原子上，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)所催化[10]。DNA甲基化參與了個(gè)體發(fā)育和細(xì)胞分化等基本生物學(xué)過程[11]。而在人類多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有DNA甲基化異常，包括基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化和全基因組低甲基化[12-13]，基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化是導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制之一[14]。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活，是肺癌發(fā)生的早期事件[15]。關(guān)于肺癌DNA甲基化的研究顯示，DNA甲基化分析可能成為肺癌早期、精確診斷的強(qiáng)有力工具，具有優(yōu)越的敏感性和特異性[16]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2 基因甲基化與肺癌有密切關(guān)系。肺癌患者腫瘤組織[17-18]、支氣管灌洗液[19-21]、外周血[22-24]、胸腔積液[25-26]、縱隔或肺門淋巴結(jié)[27-28]五種標(biāo)本中均可檢測到SHOX2 基因甲基化。SHOX2 基因甲基化是肺癌的普遍現(xiàn)象，癌組織中SHOX2 基因甲基化檢出率為96%[17]。而在支氣管灌洗液、血漿、縱隔或肺門淋巴結(jié)標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化檢出率也較高，說明這些標(biāo)本中的SHOX2 基因甲基化狀況可以很好地反應(yīng)肺癌組織中SHOX2 基因甲基化，故可以成為輔助肺癌診斷的標(biāo)志物。研究顯示，SHOX2 基因甲基化在肺癌不同病理類型、不同分期中檢出率存在差異[17，19，20，22]，吸煙與肺癌組織中SHOX2 基因甲基化顯著相關(guān)[18]，這些均提示SHOX2 基因甲基化與肺癌發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，但其中具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，并可能是很有前景的研究方向。

二、肺癌不同類型標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化檢測可輔助肺癌診斷

研究證實(shí)，SHOX2 基因甲基化可以作為一個(gè)新的肺癌標(biāo)志物，輔助肺癌診斷具有突出的敏感性和特異性。一項(xiàng)Meta分析顯示，檢測SHOX2 基因甲基化輔助肺癌診斷的敏感性為70%，特異性達(dá)到96%[29]，這一Meta分析納入的研究所涉及到的標(biāo)本包括肺癌組織、淋巴結(jié)、血漿、支氣管灌洗液、胸腔積液，涉及到1129個(gè)肺癌病例。檢測這些標(biāo)本中的SHOX2 基因甲基化輔助肺癌診斷可能被用于不同的臨床情況中。目前主要使用甲基化特異性PCR技術(shù)(試劑盒)來檢測標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化。

1. 肺癌組織

Schneider等研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)應(yīng)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常的癌旁組織相比，96%的肺癌組織標(biāo)本中可檢測出SHOX2 基因高甲基化(n=55)[17]，說明SHOX2 基因甲基化是肺癌中一個(gè)普遍現(xiàn)象，故可以作為肺癌的標(biāo)志物。此外，肺癌組織中SHOX2基因高甲基化還伴隨普遍的SHOX2基因擴(kuò)增，兩者高度相關(guān)(P<0.0001)，但這一研究并未在肺癌組織中檢測到SHOX2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的明顯變化[17]，SHOX2基因高甲基化與擴(kuò)增在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

2. 支氣管灌洗液

肺癌病人支氣管灌洗液與肺癌組織中SHOX2 基因甲基化有較高的一致性，故可以較好地反應(yīng)肺癌組織中SHOX2 基因甲基化情況。肺癌病人支氣管灌洗液中SHOX2 基因甲基化檢出率為64%-83.8%(即敏感性為64%-83.8%)，特異性可達(dá)到84.6%-98%，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值[19-21,23]。Bernd Schmidt等[19]分析了523例病人(肺癌281例，對(duì)照組242例)支氣管灌洗液標(biāo)本中SHOX2基因甲基化情況，發(fā)現(xiàn)在支氣管灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查陰性的肺癌患者標(biāo)本中，SHOX2 基因甲基化檢出率為62%[19]，由此可見，特別是在疑診肺癌而支氣管灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查又為可疑或陰性的患者中，SHOX2 基因甲基化檢測輔助肺癌診斷具有更大的價(jià)值[19]。不同病理類型中，鱗癌和小細(xì)胞肺癌SHOX2基因甲基化檢出率分別為82%和97%，而腺癌僅為47%。不同分期中，Ⅰ期肺癌SHOX2 甲基化檢出率低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌(分別為54%,72%,73%,68%)，這可能是Ⅰ期肺癌患者灌洗液中腫瘤細(xì)胞較少的緣故[19]。Dietrich等[20]也得出與Schmidt等相似的結(jié)果。此外，中央型肺癌患者支氣管灌洗液SHOX2 基因甲基化檢出率為68%，較周圍型高(56%)[19]。

臨床實(shí)踐中，經(jīng)第一次纖維支氣管鏡檢查就能確診的肺癌病例不到50%[30]。因此，在那些纖支鏡及細(xì)胞學(xué)檢查可疑或陰性的肺癌疑診病例中，進(jìn)一步行支氣管灌洗液SHOX2 基因甲基化檢測有助于肺癌的診斷及鑒別，從而可能避免行進(jìn)一步的有創(chuàng)性檢查。目前，已有用于支氣管灌洗液中SHOX2 基因甲基化檢測輔助肺癌診斷的商業(yè)化試劑盒[20]。

支氣管灌洗液SHOX2 基因甲基化作為肺癌診斷標(biāo)志物，顯著優(yōu)點(diǎn)是具有高度特異性(98%)，這種特異性可能是源于其取材部位的特異性，因支氣管灌洗液直接取材于可能發(fā)生病變部位的支氣管，不受其他部位病變的干擾。但因?yàn)槔w支鏡檢查屬有創(chuàng)檢查，故支氣管灌洗液SHOX2 基因甲基化檢測不大可能用于大規(guī)模人群的肺癌篩查。

3. 外周血

在癌癥進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞釋放DNA進(jìn)入血液循環(huán)(血游離循環(huán)DNA)，故可以在外周血(血清或血漿)中檢測到包括DNA甲基化標(biāo)志物在內(nèi)的腫瘤DNA標(biāo)志物[31-33]。研究分析了血漿中SHOX2基因甲基化情況，表明血漿中SHOX2基因甲基化也可作為肺癌診斷標(biāo)志物。Kneip等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿中SHOX2 基因甲基化檢出率為60%，即SHOX2 基因甲基化檢測診斷肺癌敏感性60%，特異性為90%[22]。鱗癌和小細(xì)胞肺癌血漿中SHOX2基因甲基化檢出率明顯高于腺癌(分別為63%、80%和39%)，Ⅰ期肺癌標(biāo)本中的甲基化檢出率也明顯低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期(分別為27%,72%,55%,83%)[22]，這些結(jié)果均與支氣管灌洗液中的結(jié)果吻合[19-20]。進(jìn)一步的分析表明，病理類型和分期與血漿SHOX2 基因甲基化存在明顯關(guān)聯(lián)[22]。而Konecny等的研究中肺癌病人血漿SHOX2 基因甲基化檢出率更高(80.65%)，鱗癌和小細(xì)胞肺癌病人標(biāo)本SHOX2甲基化檢出率均為100%，腺癌為67%[23]。

最近，Weiss等報(bào)道了檢測血漿中SHOX2和PTGER4基因甲基化組合可以鑒別肺癌和肺良性病變，同時(shí)分析這兩個(gè)甲基化標(biāo)志物，其診斷肺癌的敏感性為67%，特異性為90%[24]。

檢測血漿SHOX2 基因甲基化診斷肺癌最大的優(yōu)勢在外周血標(biāo)本獲取方便，并可重復(fù)采取標(biāo)本，操作方便，故有望應(yīng)用于大規(guī)模肺癌篩查試驗(yàn)。目前也已經(jīng)有商業(yè)化試劑盒用于外周血標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化檢測[23]。

4. 胸腔積液

胸腔積液在臨床工作中很常見，鑒別其良惡性是臨床診療的重要內(nèi)容。Llse等報(bào)道，以細(xì)胞病理學(xué)檢查作為診斷肺癌惡性胸腔積液標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)肺癌惡性胸腔積液中SHOX2 基因甲基化檢出率為40%[25]。國內(nèi)的一項(xiàng)研究也得出相似的結(jié)果，肺癌惡性胸腔積液中SHOX2 基因甲基化檢出率為35.7%[26]。這些研究說明，胸腔積液標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化檢測輔助肺癌診斷也有一定價(jià)值。

5. 淋巴結(jié)

有研究報(bào)道了肺癌病人縱隔、肺門淋巴結(jié)中SHOX2 基因甲基化的情況[27-28]。Darwiche等[28]分析了經(jīng)氣管超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)針吸活檢術(shù)(EBUS-TBNA)獲取的縱隔、肺門淋巴結(jié)標(biāo)本中SHOX2基因甲基化，發(fā)現(xiàn)在有肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中SHOX2 基因甲基化檢出率為94%，與肺癌原發(fā)病灶(96%)中相符合[17]，SHOX2 基因甲基化檢出肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的敏感性為94%，特異性達(dá)到99%，較EBUS-TBNA標(biāo)本病理學(xué)檢查的敏感性高(82%)[28]，故SHOX2 基因甲基化檢測可以輔助EBUS-TBNA病理活檢提高診斷及肺癌分期準(zhǔn)確性，從而更好地指導(dǎo)臨床治療。

三、SHOX2基因甲基化用于肺癌治療監(jiān)測及指示預(yù)后

Schmidt等[34]研究發(fā)現(xiàn)血漿SHOX2 基因甲基化可用于晚期肺癌治療的監(jiān)測。以CT檢查作為是否對(duì)治療(化療及根據(jù)情況放療)發(fā)生應(yīng)答的金標(biāo)準(zhǔn)，通過定量分析對(duì)比晚期肺癌病人(非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌)治療前和治療開始后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SHOX2 基因甲基化水平，發(fā)現(xiàn)在對(duì)治療有應(yīng)答組病例中，血漿SHOX2基因甲基化水平隨治療周期數(shù)的增加而逐漸下降。他們證實(shí)，血漿SHOX2 基因甲基化可以反映接受系統(tǒng)治療的晚期肺癌病人臨床進(jìn)程，檢測SHOX2 基因甲基化可以在治療開始一周后以較高的特異性區(qū)分出對(duì)治療發(fā)生應(yīng)答和無應(yīng)答的病例，可以較CT更敏感、更早地發(fā)現(xiàn)患者是否對(duì)治療產(chǎn)生應(yīng)答，從而指導(dǎo)治療方案的調(diào)整，或使患者免于一些無效治療[34]。但由于這項(xiàng)研究僅納入36例病例，其結(jié)論仍有待于在大樣本試驗(yàn)中驗(yàn)證。

Dietrich等分析了400多例非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中SHOX2和PITX2基因甲基化情況并經(jīng)過隨訪研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2和PITX2 基因高甲基化可以預(yù)測無進(jìn)展生存期。與兩個(gè)基因都呈較高水平甲基化的病人相比，那些SHOX2和/或PITX2 基因低甲基化水平病人術(shù)后腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[35]。這一研究提示SHOX2和PITX2 基因甲基化可以作為非小細(xì)胞肺癌疾病進(jìn)展獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物，這也進(jìn)一步提示SHOX2和PITX2 基因甲基化在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

四、展望與結(jié)語

有研究報(bào)道了檢測痰、呼出氣冷凝物等無創(chuàng)途徑獲取的標(biāo)本中p16INK4a,MGMT，RASSF1A, DAPK,APC,RARβ2，CDH1等基因甲基化[36-40]來檢測肺癌也有較高的敏感性和特異性。而目前還未見檢測痰標(biāo)本中SHOX2 基因甲基化用于肺癌診斷的研究報(bào)道。因支氣管灌洗液SHOX2 基因甲基化診斷肺癌有較高的敏感性和特異性，故推測，痰中的SHOX2 基因甲基化輔助診斷肺癌也可能有較高的敏感性和特異性，若這一點(diǎn)被將來的研究證實(shí)，則痰標(biāo)本因其完全無創(chuàng)的特點(diǎn)可能被用于SHOX2 甲基化檢測的大規(guī)模肺癌篩查或肺癌診斷試驗(yàn)。

研究已提示SHOX2 基因甲基化與肺癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但仍有待進(jìn)一步探究?？偟膩碚f，SHOX2 基因甲基化作為肺癌的一個(gè)標(biāo)志物，在肺癌診斷、治療監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估中都可能發(fā)揮一定價(jià)值，特別是在肺癌診斷方面，已經(jīng)顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，可能成為目前肺癌診斷方法的重要補(bǔ)充。此外，還可聯(lián)合檢測其他肺癌DNA甲基化標(biāo)志物，以期達(dá)到肺癌早期、精確診斷、減少診斷性有創(chuàng)檢查及降低醫(yī)療費(fèi)用的目的。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.049

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科

楊雙強(qiáng)，E-mail：yysqiang2@163.com

2016-11-15]