靳晶 王全勝

·述評·

糖尿病腎病上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化

靳晶 王全勝

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要病因，約30%～40%的1型糖尿病或2型糖尿病患者發(fā)生DN，DN的特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積聚，主要包括各種膠原，層黏連蛋白和纖連蛋白沉積在系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)、增厚的基底膜[1-3]。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積繼發(fā)導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、炎癥因子的浸潤、肌成纖維細(xì)胞的活化[1，3-4]。有報道顯示，肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量與DN患者的腎功能呈顯著負(fù)相關(guān)[5-6]。雖然有學(xué)者認(rèn)為，活化的肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞，但是該細(xì)胞的來源問題仍然是有爭議的[3，7]。最初的研究表明，腎纖維化與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)，在疾病狀態(tài)下，上皮細(xì)胞能表達(dá)成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志并且發(fā)生表型向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[7-8]。因為腎小管上皮細(xì)胞異常表達(dá)成纖維細(xì)胞特異性蛋白(fibroblast specific protein，F(xiàn)SP)，有研究提出部分肌成纖維細(xì)胞來源于腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[8-9]。Iwano等[10]發(fā)現(xiàn)腎纖維化中，36%以上的肌成纖維細(xì)胞是由局部腎小管上皮細(xì)胞EMT而來。體外的研究顯示，包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在內(nèi)的多種因子能啟動EMT[11]。Zeisberg等[12]研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)蛋白7(bone morphogenic protein 7，BMP7)能拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，能逆轉(zhuǎn)腎纖維化。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞來源于多種細(xì)胞，使EMT導(dǎo)致腎纖維化的觀點受到質(zhì)疑[4]。Humphreys等[13]采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎纖維化模型小鼠的研究，沒有發(fā)現(xiàn)EMT來源的肌成纖維細(xì)胞。因此，當(dāng)前對EMT在腎纖維化中的重要作用有激烈的爭議。本述評將總結(jié)并分析、支持或反對EMT的一些證據(jù)，討論在DN腎組織中，EMT是否能直接導(dǎo)致腎纖維化的惡性進(jìn)展。

一、腎纖維化中肌成纖維細(xì)胞的來源

腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，但是在纖維化的腎臟中，肌成纖維細(xì)胞的活化過程及來源仍然不清楚，并且存在爭議[7，14]。有研究顯示，在腎纖維化中，多種類型的細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚及重構(gòu)[15]。例如，有研究顯示，在腎纖維化模型中的肌成纖維細(xì)胞來源于骨髓細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞[16]。關(guān)于肌成纖維細(xì)胞的來源，有爭議的觀點如下：有研究支持腎纖維化中血管周邊的pericytes細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的啟動細(xì)胞；也有研究質(zhì)疑，EMT和內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生及腎纖維化中的作用[17]。有觀點認(rèn)為，腎纖維化中骨髓是所有肌成纖維細(xì)胞的來源[17]。無論如何，明確肌成纖維細(xì)胞不同種類的特征及行為確定腎臟肌成纖維細(xì)胞的來源是很重要的[18]。當(dāng)前，對其來源問題的研究結(jié)果是差異極大的。Lin等[19]研究提示，少于0.1%的肌成纖維細(xì)胞是骨髓來源的細(xì)胞。Lebleu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，35%的肌成纖維細(xì)胞來源于骨髓，同樣在關(guān)于腎小管上皮細(xì)胞EMT導(dǎo)致腎纖維化的研究中存在很大的差異。有報道36%的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[10]、有報道為5%[17]，有報道是幾乎沒有腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[13]。這些結(jié)果都是采用UUO腎病模型研究得到的。由于UUO腎病模型能模擬伴有腎小管損傷的腎纖維化的各種關(guān)鍵性的特征，因此成為研究腎纖維化的經(jīng)典模型[18]。然而，當(dāng)前的研究表明，腎臟中產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞來源于多種細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓腔內(nèi)膜細(xì)胞[3，18]。Lebleu 等采用多種基因工程小鼠來示蹤細(xì)胞，檢測在UUO小鼠10 d后的腎纖維化中的肌成纖維細(xì)胞的來源和功能，并且證實所有的肌成纖維細(xì)胞呈異質(zhì)性。聚集的肌成纖維細(xì)胞主要有兩種不同的來源：①50%是固有成纖維細(xì)胞局部增殖的；②35%是骨髓來源的細(xì)胞。另外，他們發(fā)現(xiàn)腎纖維化中，一定數(shù)量的腎小管上皮細(xì)胞獲得α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，大約5%的肌成纖維細(xì)胞是真正來源于腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生完整的EMT。他們證實，10%的肌成纖維細(xì)胞是來源于內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[17]。像EMT一樣，內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，通過增加腎小球及腎小管間質(zhì)中的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，參與腎臟纖維化[14，20]，同時他們也發(fā)現(xiàn)UUO中pericytes細(xì)胞不參與腎纖維化[13，17-18]。這與Humphreys等[13]報道超過90%的肌成纖維細(xì)胞來源于活化的pericytes細(xì)胞是完全不一致的。腎臟纖維化中的肌成纖維細(xì)胞還有一種來源是腎小球上皮細(xì)胞即足突細(xì)胞。有研究顯示，足突細(xì)胞損傷后能發(fā)生EMT，導(dǎo)致足突細(xì)胞功能紊亂最終導(dǎo)致腎小球濾過率的減少[21]?？傊?，在腎纖維化中的成纖維細(xì)胞來源于多種不同的細(xì)胞，但是很少有研究來確定，特別是在DN中，是否當(dāng)前形容的導(dǎo)致腎纖維化不同類型細(xì)胞的比例是相同的或不同？在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，由EMT產(chǎn)生的比例是多少？目前有一些研究顯示，在DN腎纖維化進(jìn)程中的確發(fā)生了EMT。例如在2型糖尿病引起的DN患者中，α-SMA陽性的細(xì)胞總是在腎間質(zhì)區(qū)，而且是圍繞在腎小管基底膜周圍或之間[22]。有報道發(fā)現(xiàn)，在DN的實驗及臨床研究中，除了足突細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以外，系膜細(xì)胞也是肌成纖維細(xì)胞的另外一種來源，該過程稱為肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化即腎小球系膜細(xì)胞正常的表型發(fā)生改變，變成了肌成纖維細(xì)胞，從而產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)，而且腎纖維化中肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是骨髓來源的前體細(xì)胞變成肌成纖維細(xì)胞的機(jī)制[15]。

二、腎臟細(xì)胞向活化的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的機(jī)制

盡管體內(nèi)EMT或內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化在腎纖維化中是否起重要作用，當(dāng)前的文獻(xiàn)資料還存在爭議，但是在體外的研究中，腎臟細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞的確存在，有多種因子及信號通路參與該過程。TGF-β1是啟動及完成EMT或內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化最有力的誘導(dǎo)因子[1，5，7，16，23-26]。EMT是一種復(fù)雜的表型改變，上皮細(xì)胞失去緊密的細(xì)胞間連接并且其結(jié)構(gòu)極性變成紡錘體樣形狀，像間充質(zhì)細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞[27]。EMT中關(guān)鍵事件是上皮細(xì)胞間緊密連接的破壞、細(xì)胞頂部與底部極性的消失、細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞形態(tài)的改變、上皮細(xì)胞的基因表達(dá)下調(diào)、間充質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞的游走性增加[26]。EMT過程有4個關(guān)鍵的事件：①上皮細(xì)胞間的黏附消失；②新基因α-SMA的表達(dá)和肌動蛋白的重組；③腎小管基底膜被基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)裂解；④細(xì)胞的遷移能力和侵襲周圍腎間質(zhì)的能力提高[7，28]。細(xì)胞的這種遷移能力導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積增加，因而使EMT在腎小管間質(zhì)纖維化中起關(guān)鍵作用[4]。EMT的早期階段是上皮細(xì)胞間緊密連接的分解和細(xì)胞極性的消失[23，26]。上皮細(xì)胞的基因表達(dá)受抑制的同時，間充質(zhì)細(xì)胞的基因活化[26]，接著上皮細(xì)胞的肌動蛋白結(jié)構(gòu)的重組、上皮細(xì)胞失去鵝卵石樣形態(tài)變成拉長的紡錘體樣形態(tài)，同時伴隨有新的基因α-SMA的表達(dá)[11，26]。當(dāng)上皮細(xì)胞從腎小管基底膜釋放后，它們通過被MMP破壞的基底膜的缺口侵襲到腎間質(zhì)[3]。體外研究報道，完整的腎小管基底膜是保持上皮細(xì)胞表型的必須條件，它的破壞足夠啟動EMT[11]。大量的研究報道，EMT的進(jìn)展受多種信號通路或分子的調(diào)節(jié)能相互協(xié)作誘導(dǎo)完整的EMT過程。例如Smad、p38 MAPK、TLRs、Wnt、SGK1、Notch、小分子GTPase和 Hedgehog 等通路能參與EMT[1，26，29-31]，miRNAs也參與EMT[32-33]。腎小球上皮細(xì)胞(足突細(xì)胞)同樣能發(fā)生EMT[34]。足突細(xì)胞是一種非常特別的上皮細(xì)胞，它們覆蓋在腎小球基底膜外側(cè)，在調(diào)節(jié)腎小球功能中起非常重要的作用[35]。在DN患者及多種不同的DN動物模型中都有蛋白尿的發(fā)生，同時有足突細(xì)胞表型發(fā)生改變及其運動能力的增加和新的基因標(biāo)志表達(dá)發(fā)生[36]。最近的報道提示，EMT是DN足突細(xì)胞丟失的一種新的解釋[21，34，37]。其他的研究還表明，在包括DN的多種慢性腎臟病小鼠模型中，內(nèi)皮細(xì)胞通過向間充質(zhì)細(xì)胞分化獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能[14，20，38-40]。像EMT一樣，在內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化過程中，內(nèi)皮細(xì)胞失去黏附性和頂部-基底部的極性產(chǎn)生高度的侵襲性、遷移性、紡錘樣拉長樣間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)[41]。內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化是一種復(fù)雜的生物學(xué)過程，腎小管間質(zhì)血管和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞失去特有的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志(如血管內(nèi)皮cadherin 和CD31)，獲得間充質(zhì)細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞表型α-SMA、vimentin和I型膠原[42]。除此之外，它們還有運動性及遷移到周圍組織的能力[42]。與EMT一樣，TGF-β家族信號蛋白、高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)和血管緊張素Ⅱ能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化[5，16]。

三、體外糖尿病環(huán)境下EMT和內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞分化的證據(jù)

TGF-β1、高糖和AGEs能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞(足突細(xì)胞)EMT以及內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化。大量研究顯示，TGF-β1、高糖及其他糖尿病環(huán)境因素刺激腎小管上皮細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞(足突細(xì)胞)48～72 h，這些上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程中有兩種關(guān)鍵事件發(fā)生：在不同的腎小管上皮細(xì)胞或足突細(xì)胞中，上皮細(xì)胞標(biāo)志減少(如E/P-cadherin、ZO-1)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白(如α-SMA、vimentin)增加[12，33，37，43-51]。其他的研究觀察EMT中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及定位的改變(如β-catenin、Snail、Twist等)，還觀察了細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原和纖連蛋白的改變[21，33，44-45，52-53]。研究證實，EMT有4個關(guān)鍵的事件：TGF-β1刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞3 d后，細(xì)胞出現(xiàn)E-cadherin表達(dá)下降伴有α-SMA表達(dá)及肌動蛋白的重組。細(xì)胞分泌MMP2 和MMP9能裂解15 μm的與腎小管基底膜(tubular basement membrane，TBM)基質(zhì)成分相近的明膠，細(xì)胞出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞形態(tài)，并有遷移及侵襲性[28]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，體外重組的人BMP-7能逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞及足突細(xì)胞的EMT[12，50]，肝細(xì)胞生長因子也能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT[54]。高糖誘導(dǎo)TGF-β1增加，繼而通過減少connexin-43表達(dá)，導(dǎo)致人近端腎小管上皮細(xì)胞黏附降低[55]。Connexins是一組家族轉(zhuǎn)膜蛋白，能與多種黏附分子及結(jié)構(gòu)蛋白(如ZO-1、N-cadherin)配對。在體外糖尿病環(huán)境、糖尿病小鼠模型及DN患者中，足突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的Connexins表達(dá)下調(diào)[56]。

四、DN體內(nèi)EMT及內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化的證據(jù)

因為EMT是一個可塑的過程并有多種中間狀態(tài)，所以體內(nèi)發(fā)現(xiàn)EMT的證據(jù)較困難[57]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，DN中有EMT和內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)生，并在DN進(jìn)展中起重要作用。Oldfield等[43]研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠腎組織中，大約5%腎小管細(xì)胞表達(dá)α-SMA，這表明腎小管上皮細(xì)胞EMT的確存在。他們還發(fā)現(xiàn)，在1型DN患者腎穿刺標(biāo)本中，在完整的腎小管中的上皮細(xì)胞有α-SMA表達(dá)。其他的報道顯示，在2型糖尿病患者腎臟組織中的一些腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)基底部的細(xì)絲變成束狀，這強(qiáng)烈支持EMT理論。因為，這些變化是反映了細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)與結(jié)構(gòu)的改變，是EMT的關(guān)鍵事件[22]。另外，在STZ誘導(dǎo)的DN中，上皮細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志(E-cadherin和ZO-1)減少，同時α-SMA的合成及間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白出現(xiàn)[2]，這與其他在DN患者腎穿刺標(biāo)本及DN動物模型中的研究一致[44-45，58]。Rastaldi等[58]研究發(fā)現(xiàn)，EMT標(biāo)志蛋白與血肌酐及腎間質(zhì)損傷有相關(guān)性。Zheng等[59]研究尿中EMT標(biāo)志分子的mRNA與DN患者腎臟進(jìn)展相關(guān)性，他們發(fā)現(xiàn)DN患者中α-SMA、纖連蛋白和MMP-9明顯增加，并且與尿白蛋白及血尿素氮呈明顯相關(guān)。足突細(xì)胞的損傷在DN進(jìn)展中起重要作用，足突細(xì)胞EMT導(dǎo)致足突細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致腎小球濾過率下降。有研究顯示，在STZ誘導(dǎo)的早期DN模型中，足突細(xì)胞的表型發(fā)生改變，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin減少[21，37]。在1型及2型糖尿病患者中，腎小球的nephrin及ZO-1表達(dá)下降[21，34，60]。Li等[21]采用免疫組織化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)，DN患者中腎小球足突細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白nephrin和ZO-1表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、MMP9和FSP1表達(dá)上調(diào)。日本學(xué)者Yamaguchi 等[34]發(fā)現(xiàn)，在2型DN患者尿液及腎組織中有FSP1陽性的足突細(xì)胞，而且FSP1陽性的足突細(xì)胞與患者的臨床及病理損傷的嚴(yán)重性有相關(guān)性。Zeisberg等[20]研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞來源的成纖維細(xì)胞促進(jìn)了STZ誘導(dǎo)的DN小鼠早期腎間質(zhì)纖維化，在6個月的STZ誘導(dǎo)的DN小鼠中，他們通過基因示蹤技術(shù)和免疫雙染色法標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白(FSP1/CD31及α-SMA/CD31)，發(fā)現(xiàn)約40%FSP1陽性的細(xì)胞和50%α-SMA陽性的細(xì)胞同時表達(dá)CD31，提示這些成纖維細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞來源的。Li等[38]研究提示，在DN中內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化是腎間質(zhì)及腎小球肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生新的機(jī)制。他們運用內(nèi)皮細(xì)胞示蹤的小鼠細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠1個月時，10%的腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞來源于內(nèi)皮細(xì)胞；在4個月時，25%腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞是來源于內(nèi)皮細(xì)胞。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Smad3能抑制DN腎損傷的早期發(fā)展及AGE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化[39]。這些研究證實，在DN小鼠腎組織中25%～50%的成纖維細(xì)胞共表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志和成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志(如FSP1和α-SMA)。

五、對EMT的綜合分析

1.EMT是一個高度動態(tài)過程 當(dāng)前(2017年1月22日)，在pubmed用關(guān)鍵詞“epithelial-to-mesenchymal transition”和“kidney fibrosis”檢索，得到712篇文獻(xiàn)，其中近5年有384篇。用關(guān)鍵詞“epithelial-to-mesenchymal transition”和“diabetic nephropathy”檢索得到140篇文獻(xiàn)，其中有98篇文獻(xiàn)是近5年的。這些大量的文獻(xiàn)表明，EMT在腎纖維化及DN中的研究仍然是一個研究的熱點。盡管腎纖維化體內(nèi)EMT的存在仍然遠(yuǎn)未得到證實，但是很多研究者支持在腎纖維化中EMT是一個真實的現(xiàn)象。盡管有EMT的反對者，如Jeremy Duffield用細(xì)胞示蹤技術(shù)的體內(nèi)研究沒有證實到腎纖維化中上皮細(xì)胞的遷移及分化為肌成纖維細(xì)胞[61]。盡管用細(xì)胞示蹤技術(shù)的實驗檢測體內(nèi)腎臟成纖維細(xì)胞的來源被廣泛接受，但是如何在體內(nèi)檢測EMT的問題仍然存在。證實EMT發(fā)生的理想方法需要用實時監(jiān)測的方法觀察并追蹤上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞并遷移到腎間質(zhì)，但是當(dāng)前的技術(shù)是無法完成的，替代的方法僅用組織化學(xué)技術(shù)對腎纖維化組織，對EMT過程進(jìn)行簡單快速定時檢測[14，61]。有一些研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生部分EMT表型證實細(xì)胞同時表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志[25，48，62]。因此，EMT變成成纖維細(xì)胞的確是一個高度動態(tài)過程，EMT不需要完成一個完整的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型，而是能停止在各種時期[61]。

2.當(dāng)前存在2個根本性的問題 腎纖維化中體內(nèi)EMT是否真的發(fā)生？EMT是否促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化？或換一句話講，EMT是在慢性腎臟病腎纖維化中還是僅在DN腎纖維化中起關(guān)鍵作用[7]？如本文中討論的，無論是小鼠還是人的腎活檢標(biāo)本，大量的EMT研究是集中在EMT初期，不能提供EMT體內(nèi)存在的直接證據(jù)。無論如何，綜合這些揭示腎纖維化中上皮細(xì)胞侵襲到腎間質(zhì)并轉(zhuǎn)分化為活化的肌成纖維細(xì)胞的獨立研究，這些支持EMT的證據(jù)是不能被忽略的。另一方面，來自Humphreys、Koesters和Faulkners的細(xì)胞示蹤研究未能檢測到腎纖維化體內(nèi)EMT的任何證據(jù)，特別是Koesters等[63]在TGF-β誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化模型中未能檢測到EMT的貢獻(xiàn)。大多數(shù)研究是采用α-SMA和FSP1的表達(dá)作為腎小管上皮細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的代表性標(biāo)志，但是有爭論表明α-SMA和FSP1不是可靠的標(biāo)志，因為他們?nèi)狈?xì)胞特異性和持續(xù)性[7，61]。FSP1在受傷的腎組織的白細(xì)胞中也表達(dá)。因此，F(xiàn)SP1是否能作為成纖維細(xì)胞特有的蛋白是受到質(zhì)疑的[61，64]。有趣的是，足突細(xì)胞也表達(dá)FSP1，表明足突細(xì)胞發(fā)生EMT是可能的[64]。綜合這些DN中EMT的研究，Humphreys等[13]未能在UUO模型中發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA的研究是值得關(guān)注的。這些研究的差異性可能是不同的實驗設(shè)計及EMT過程的復(fù)雜性導(dǎo)致的。當(dāng)前的研究共識是，EMT是像波浪樣的極度動態(tài)過程，正確的時間選擇是檢測EMT的重要因素[7]。如Liu等[45]證明，在STZ誘導(dǎo)的大鼠DN中有EMT發(fā)生，DN模型2周后，發(fā)現(xiàn)腎組織中E-cadherin的表達(dá)減少同時纖連蛋白的表達(dá)急劇增加，但是延遲到建模12周才有α-SMA的表達(dá)上調(diào)。有趣的是，在人DN腎臟組織EMT過程中都有α-SMA的延遲表達(dá)或表達(dá)極低[9]。EMT的主要研究高度依賴于檢測動態(tài)轉(zhuǎn)型細(xì)胞共表達(dá)上皮細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，但是對假定的中間形態(tài)的轉(zhuǎn)型細(xì)胞持續(xù)的時間及命運還不知道。由于，EMT的轉(zhuǎn)型時間非常短暫，因而腎組織的檢測分析時間的選擇存在爭論[7，61]。可是，UUO小鼠模型是否是一個好的模擬人腎纖維化的模型，還有爭論因為腎損傷的產(chǎn)生，在UUO小鼠僅數(shù)月，而人是數(shù)年[11]。在DN 3期及4期患者中，是肌成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的DN腎小管間質(zhì)纖維化最明顯階段[22]。Koesters等[63]對UUO建模后僅4 d小鼠的腎組織進(jìn)行分析，盡管該時期的腎組織有腎纖維化的各種特征包括小管的損傷等，但是未能檢測到腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。因此，還存在疑問的是，UUO小鼠模型中發(fā)生的一切腎臟事件能否應(yīng)用到其他類型的腎纖維或者能否反映人的UUO腎臟病理經(jīng)過[18，59]。近期的研究報道，在不同的腎臟病模型中EMT對腎纖維化的貢獻(xiàn)不同[65-66]。Inoue等[66]推測不同實驗條件(包括疾病模型)、小鼠品系的遺傳背景、基因型的改變能導(dǎo)致EMT參與腎纖維化的差異性。為證明這種可能性，他們通過控制γ-glutamyl 轉(zhuǎn)肽酶啟動子改變遺傳基因，在腎皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞中，高表達(dá)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)的幾種品系的小鼠中制造腎臟疾病模型。他們發(fā)現(xiàn)腎組織中EMT的發(fā)生及促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，依賴于特異性腎病和小鼠的品系。例如，通過使用Humphreys等同樣的小鼠UUO模型，Inoue等檢測到表達(dá)EGFP陽性的腎間質(zhì)細(xì)胞，而且EMT的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)。特別重要的是，他們用一種對腎纖維化有抵抗的品系小鼠制造UUO模型，雖然有腎間質(zhì)的病變，但是沒有檢測到EGFP陽性的腎間質(zhì)細(xì)胞。這和其他前期的研究報道，在UUO模型中EMT發(fā)生率極低是一致的[65-66]。有文獻(xiàn)報道，在不同的腎臟疾病模型中用不同的方法來檢測EMT存在不一致的研究結(jié)果[67]。由于實驗方法的不一致性，為檢測EMT的小鼠品系和腎病模型應(yīng)該有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[9]。因此，Zeisberg等[57]提出研究EMT的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)該包括4個關(guān)鍵事件中每一個事件中一種改變的標(biāo)志蛋白，達(dá)到研究相同現(xiàn)象的結(jié)果一致性，而且用多種標(biāo)志而不是單一標(biāo)志，同時檢測上皮細(xì)胞EMT相關(guān)改變更加可信。因為，實時觀察上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞并遷移到腎間質(zhì)是無法完成的，并建議同時檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志(如N-cadherin、E-cadherin和ZO-1)細(xì)胞骨架蛋白(如α-SMA和vimentin)，轉(zhuǎn)錄因子信號(如Snail、Slug、Twist和FOXC2)和分泌的microRNAs的水平的改變是檢測體內(nèi)EMT存在的好方法[9，57]。最近的一項研究，通過檢測EMT4個類別中，每一類別多個標(biāo)記，證實STZ誘導(dǎo)的DN模型腎組織中的EMT的重要作用[2]。像Simonson提出的爭議問題，要證明EMT促進(jìn)DN腎纖維化，需有兩種事實證據(jù)：①細(xì)胞外能誘導(dǎo)EMT的因素也應(yīng)該促進(jìn)DN模型腎纖維化；②EMT的抑制因子能減輕或阻斷DN模型中腎纖維化進(jìn)程[15]。必須強(qiáng)調(diào)的是，在體內(nèi)腎小管上皮細(xì)胞暴露在血液中，與體外細(xì)胞的實驗相比較，血液中每一種因子的濃度都很低[27]。另一方面，在體內(nèi)糖尿病環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞受到多種潛在EMT誘導(dǎo)因素刺激，這與UUO模型不同。針對Simonson的第二個爭論的問題，有研究顯示，給予BMP7或肝細(xì)胞生長因子能阻斷腎小管上皮細(xì)胞EMT，同時能逆轉(zhuǎn)慢性腎臟病腎損傷[3，12，54]。還有研究報道，二甲雙呱(一種治療2型糖尿病的藥物)，能夠通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，防止腎小管的損傷[68-69]。最近的研究顯示，Snail1能誘導(dǎo)梗阻性腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生部分EMT，導(dǎo)致腎纖維化，抑制Snail1能減輕腎纖維化。敲除Snail或Twist基因，能減輕梗阻性腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT，繼而抑制腎損傷，保護(hù)腎小管功能[70-71]。這些研究強(qiáng)烈支持EMT在慢性腎臟病特別是DN腎纖維化中起關(guān)鍵性作用。綜合考慮，腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足突細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)DN腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的事實，這些是EMT和內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化對DN患者腎臟病理生理有顯著作用的強(qiáng)有力證據(jù)。

六、總結(jié)

本文是針對DN中是否存在EMT，一個過去有較大爭論的問題。目前，有大量的文獻(xiàn)證據(jù)支持EMT不僅發(fā)生在體外，同時也發(fā)生在DN體內(nèi)，這種觀點被廣泛接受。盡管有較堅實的體內(nèi)研究反對EMT是腎纖維化中肌成纖維細(xì)胞的來源。大多數(shù)研究者仍然強(qiáng)烈支持DN腎組織中肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，與腎小管基底膜的厚度及破壞、與腎間質(zhì)纖維化之間存在直接的聯(lián)系，而且我們相信EMT在DN腎纖維化發(fā)展進(jìn)程中起重要作用。另外，這里討論的來自于獨立原始研究文獻(xiàn)的大量數(shù)據(jù)，使我們相信EMT和內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化至少在一定程度上的確存在，它們在DN腎纖維化發(fā)展中不能被忽視。因為，目前DN中腎臟上皮細(xì)胞或腎臟內(nèi)皮細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的精確比例是完全不知道。為了解更多，期望上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞示蹤的小鼠用于STZ或基因改造誘導(dǎo)的DN模型中。所以，當(dāng)前DN腎纖維化中的研究觀點不存在實質(zhì)性矛盾。

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10.3969/j.issn.1671-2390.2017.02.001

2014年湖北省自然科學(xué)基金面上項目資助(No.2014CFB408)；第49批教育部留學(xué)歸國人員科研啟動基金

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；靳晶現(xiàn)在武漢市中醫(yī)醫(yī)院腦病科工作

王全勝，E-mail：wangquansheng@hust.edu.cn

2017-01-31)