劉勇，貝偉杰，崔同濤，王坤，李華龍，陳紀言，譚寧，陳世群，陳鵬遠

［廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣州510080］

·綜述·

長鏈非編碼RNA調(diào)控自噬在急性心肌梗死后造影劑所致腎損傷中的發(fā)生機制△

劉勇，貝偉杰，崔同濤，王坤，李華龍，陳紀言，譚寧，陳世群，陳鵬遠

［廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣州510080］

急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者行急診經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治療后造影劑所致急性腎損傷（contrast induced-acute kidney injury，CI-AKI）發(fā)生率高，且增加近期和遠期不良心腎事件。腎小管上皮細胞的自噬在急性腎損傷的發(fā)生中起著重要作用，生物信息學分析包括gene ontology（GO）富集、通路分析發(fā)現(xiàn)，Lgmn與哺乳動物參與自噬的特異性基因becclin-1基因可以富集在一起，兩者之間具有功能相似性，尚不明確長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是否通過Lgmn調(diào)控自噬而影響CI-AKI發(fā)生，本文對LncRNA參與自噬調(diào)控在急性心肌梗死后造影劑所致腎損傷中的發(fā)生機制進行綜述。

心肌梗死；LncRNA；自噬；造影劑；急性腎損傷

造影劑導致的急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）是經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治療的常見并發(fā)癥，它可延長患者的住院時間、增加住院費用和增加病死率，從而增重社會醫(yī)療負擔［1-2］。行急診PCI治療的ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患 者是發(fā)生CI-AKI的高危人群［3-5］，CI-AKI的發(fā)生顯著增加STEMI患者死亡等不良事件發(fā)生風險，即便是血流動力學相對穩(wěn)定的左心室射血分數(shù)保留的STEMI患者也如此［6］。

目前認為AKI的發(fā)生與自噬、凋亡等機制相關(guān)［7-8］，但自噬是否參與CI-AKI的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。Beclin-1基因也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。近年研究發(fā)現(xiàn)，其廣泛參與AKI的自噬發(fā)展過程［9］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一組轉(zhuǎn)錄物長度為200 nt（核苷酸），缺少特異完整開放閱讀框并且無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，在細胞周期、增殖、遷移和代謝等方面發(fā)揮重要作用［10］。mRNA是從DNA轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈RNA，其作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定肽鏈的排列順序。隨著LncRNA功能逐步顯現(xiàn)，其發(fā)揮調(diào)節(jié)的機制成為進一步研究的熱點。早期認為原位調(diào)控是LncRNA作用的唯一機制，它通過招募形成染色質(zhì)修飾復合物而沉默臨近基因轉(zhuǎn)錄，后研究發(fā)現(xiàn)LncRNA的遠程調(diào)控在生物體內(nèi)廣泛存在。LncRNA的作用機制非常復雜，至今尚未完全清楚，目前發(fā)現(xiàn)的參與哺乳動物基因活動的LncRNA有上千個，其調(diào)控基因表達的機制具有共性，一般來說，LncRNA主要從表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等3個層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控［11］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)CI-AKI組的自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達升高，LncRNA XLOC_036125和與之空間位置相鄰的Lgmn亦表達升高，且通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Lgmn與beclin-1功能相似。但是，尚不明確LncRNA是否通過Lgmn調(diào)控腎小管上皮細胞自噬而影響CI-AKI發(fā)生。因此，本文將在前期研究基礎上，結(jié)合國內(nèi)、外的研究狀況及發(fā)展動態(tài)，闡述建立貼近臨床急性心肌梗死并注射造影劑致AKI的動物模型的優(yōu)越性和必要性，為下一步開展基于LncRNA通過Lgmn調(diào)控腎小管上皮細胞自噬的研究提供依據(jù)，為臨床逆轉(zhuǎn)CI-AKI的發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)，為解決臨床棘手STEMI患者急診PCI治療后導致的AKI提供一種新策略。

1 急性心肌梗死后造影劑所致腎損傷模型

目前認為CI-AKI發(fā)病機制為全身血流動力學改變導致的腎髓質(zhì)缺血、缺氧和造影劑對腎小管上皮細胞的直接損傷［12］，令人遺憾的是，既往關(guān)于CI-AKI的基礎研究大部分基于相同的CI-AKI動物模型，如通過聯(lián)合脫水，使用非甾體類藥如吲哚美辛、腎毒性藥物如順鉑，高滲造影劑如泛影葡胺等，建立大鼠的CI-AKI模型［13］。Liu等［14］通過在5/6-腎切除聯(lián)合脫水大鼠，評價兩種造影劑的適用性；Fernandes等［15］利用5/6腎切除大鼠研究慢性高血糖和慢性腎病患者在診斷或介入治療時造影劑對腎功能的影響；Su等［16］在高滲造影劑碘普羅胺誘導的CI-AKI大鼠研究阿托伐他汀對糖尿病腎小管細胞凋亡的保護作用及其機制。然而，這與臨床實踐中患者發(fā)生CI-AKI的機制明顯不同。并且，目前臨床相關(guān)的指南已明確建議，患者在接觸造影劑前停用非甾體類藥物和避免使用腎毒性藥物及高滲造影劑等，而建議使用低滲或者等滲造影劑。

除了造影劑的使用，缺血（例如低灌注、術(shù)后出血、脫水、休克或膿毒癥等）也是臨床患者發(fā)生AKI的一大病因。對于缺血導致的AKI也被進行了大量的研究，如Le Clef等［17］對沒有行腎對側(cè)切除術(shù)的小鼠進行單側(cè)腎缺血再灌研究AKI導致的長期腎小管間質(zhì)纖維化的研究進展；Peer等［18］使用摘除單側(cè)腎，同時對對側(cè)腎進行完全缺血再灌注的SD大鼠模型評價外源性DNAse-I是否能在發(fā)生AKI時對腎臟起到保護作用；Wei等［19］對胖鼠進行單側(cè)腎臟缺血再灌注誘導腎損傷，研究替米沙坦對腎臟的保護作用。20多年來，腎完全缺血再灌模型被用來研究人類缺血性腎臟疾?。?0-21］。簡單統(tǒng)一的腎臟損傷反應導致這種模型被腎臟的研究者廣泛使用。雖然大量的對于AKI的認識來源于這個模型，但是它是否能適當?shù)胤从橙祟惾毖阅I臟疾病仍然是一個大問題。除了在腎部分切除術(shù)中，所有別的形式的AKI在人類的發(fā)生、發(fā)展中并不是由于完全阻斷血液的供應。因此，潛在的機制和受到影響的細胞類型可能完全不同。已有研究證明，對動物行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)導致小鼠出現(xiàn)與臨床患者行心肺通路手術(shù)后具有相似的腎病發(fā)病機理，肌酐的升高和時間的進程與心肺通路手術(shù)后的情況非常相似。而且，AKI的嚴重程度與人類的AKI也十分的相似，與在人類中的研究相一致，中性粒細胞相關(guān)載脂蛋白（neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL）、腎臟損傷分子-1（kidney injury molecules-1，KIM-1）腎臟中的表達量顯著升高［22］，說明這個模型與臨床上缺血性腎病是非常接近的。

臨床上的CI-AKI大多發(fā)生在對STEMI患者進行診斷或者行急診PCI治療后，發(fā)生CI-AKI的主要因素包括了STEMI患者血流動力學相對不穩(wěn)定、左心室功能異常導致全身灌注不足。有研究證實，CI-AKI在急性冠狀動脈綜合征患者的發(fā)生率明顯高于穩(wěn)定型冠狀動脈疾病患者，且在穩(wěn)定型冠狀動脈疾病患者調(diào)整后的預后影響的復合終點更明確［23］。臨床上，CI-AKI發(fā)生、發(fā)展的影響因素有很多，包括造影劑、血流動力學狀態(tài)、低血壓、充血性的心臟衰竭等［1］。造影劑的使用與缺血作為STEMI患者發(fā)生AKI的兩大影響因素，現(xiàn)階段普遍使用的CI-AKI動物模型卻并未將兩者之間聯(lián)系起來，建立與臨床CI-AKI發(fā)生機制相似的動物模型對于將CI-AKI的研究轉(zhuǎn)化于臨床運用，具有必要性。

2 自噬在急性腎損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用

自噬是由溶酶體介導的對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甚至整個細胞器進行降解和對營養(yǎng)物質(zhì)回收，維持細胞內(nèi)環(huán)境未定的生物過程。自噬現(xiàn)象在真核生物中的生物反應中普遍存在，是細胞反應于代謝、遺傳、感染、缺氧等刺激的一種必不可少的細胞存活的適應途徑［24-26］。

目前已知自噬的作用機制過程包括：（1）由雙層膜結(jié)構(gòu)始發(fā)；（2）雙層膜結(jié)構(gòu)的擴張延伸；（3）分化成熟成為自噬小體；（4）與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體；（5）包裹攝入物質(zhì)的降解［27］。研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能參與氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、TP53通路、BCL家族蛋白通路、UNC-51激酶1（unc-51-like kinase1，ULK1）及缺氧反應等信號通路調(diào)節(jié)細胞損傷。1998年Beth等在酵母的雜交克隆篩選中發(fā)現(xiàn)Beclin-1通過與磷酸肌醇3激酶（PI3K）結(jié)合而參與早期自噬的調(diào)節(jié)，參與自噬體的形成及調(diào)節(jié)其他自噬蛋白在自噬前體膜的定位。Beclin-1促進自噬小泡的成核和從細胞溶質(zhì)招募蛋白質(zhì)，是自噬體形成的標志。

自噬已被證實與大量的人類疾病，如神經(jīng)退行性疾病、感染性疾病、癌癥和炎癥性疾病的發(fā)病機制存在關(guān)聯(lián)性。Boya等［24］在研究自噬在視覺系統(tǒng)中的作用中發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜細胞的自噬功能障礙能導致一系列視覺系統(tǒng)疾病，比如黃斑變性、青光眼；Lopes de Faria等［28］在研究探討自噬是否參與高糖飲食引起的糖尿病視網(wǎng)膜病變時發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境能導致溶酶體功能障礙，引起自噬通路上的p62/SQTSM1大量堆積，致使視網(wǎng)膜細胞發(fā)生自噬功能障礙，導致細胞死亡。大量研究也證實了自噬在一些腎臟疾病發(fā)病機制中的作用，如糖尿病腎病、梗阻性腎病，IgA腎病，腎病性胱氨酸、馬兜鈴酸腎病、自身免疫性腎臟疾病和慢性環(huán)孢素A腎毒性。有關(guān)研究證明，糖尿病能引起的明顯的腎小球細胞凋亡，而激活腎細胞的自噬功能能顯著改善腎臟功能的混亂、腎小管的破壞、腎小管細胞的凋亡、線粒體的腫脹、氧化應激和炎癥反應，降低腎小球腎小管的損傷，對腎臟起到一個保護作用［29］。Wu等［30］發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注大鼠模型腎小管中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3表達增加，腎臟在此病理條件下自噬被激活。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑處理的RPTC細胞中，通過藥理抑制劑或基因敲除Beclin-1可抑制自噬過程，進而增加細胞凋亡，由此表明在順鉑誘導腎小管細胞損傷中，自噬可能具有保護作用。另外，通過具有腎素性的環(huán)孢霉素預處理的原代培養(yǎng)近端管狀細胞中也發(fā)現(xiàn)自噬有參與細胞保護作用。而Wu等［30］在大鼠的腎臟缺血-再灌注實驗中也發(fā)現(xiàn)在損傷的腎小管中，Beclin-1和LC3表達以及細胞凋亡表達同時增加，自噬及凋亡均能被缺血性預處理所抑制，最終觀察發(fā)現(xiàn)腎損傷的程度得到改善，由此反映自噬可能參與加速細胞死亡的過程。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，造影劑可直接作用于腎小管上皮細胞，導致腎小管上皮細胞極性喪失，單向離子轉(zhuǎn)運功能受損，細胞與細胞間、細胞與細胞基質(zhì)間黏附能力下降，導致上皮細胞凋亡，造成急性腎功能損傷［12，31］。AKI可導致缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子缺乏、能量欠缺、氧化損傷及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而誘發(fā)自噬的產(chǎn)生。而自噬可通過細胞保護機制降低大分子物質(zhì)及細胞器損傷以應對應激反應［31］。因此，自噬在AKI中起重要作用，同時也是AKI新的作用靶點。目前，自噬機制在AKI發(fā)生、發(fā)展過程中是否具有抗凋亡作用或促細胞死亡機制尚不清楚，在CI-AKI中更是沒有相關(guān)研究。因此，加深對腎小管上皮細胞自噬調(diào)控機制的研究，探討其有效的防治措施，對延緩造影劑暴露后腎功能損傷的進程具有重要意義。

3 急性腎損傷中長鏈非編碼RNA的差異表達

LncRNA廣泛參與基因組的調(diào)節(jié)，其中最重要的功能就是參與基因組的表觀遺傳修飾，表觀遺傳的改變主要涉及DNA甲基化、核小體定位改變、miRNA表達異常、組蛋白乙?；?、染色質(zhì)重構(gòu)等過程［32］。研究已發(fā)現(xiàn)，LncRNA可導致染色質(zhì)修飾復合物至特定的基因位點或特異性啟動子區(qū)域，從而影響與細胞周期、細胞分化、凋亡、DNA修復、細胞黏附等相關(guān)基因的表達。

作為近幾年生命科學研究最火的領域之一，LncRNA已被大量證實參與了多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，提示LncRNA可能作為多種疾病診斷和預后的新型生物標志物。Yan等［33］在循環(huán)LncRNA尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）基因作為標記物用于急性心肌梗死的研究中發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者早期狀態(tài)下，血漿中UCA1濃度會降低，但其濃度在急性心肌梗死后第3天會增加。此外，UCA1變化與微小RNA-1的表達呈負相關(guān)性。Huang等［34］在對心臟標本行全基因組轉(zhuǎn)錄的分析中發(fā)現(xiàn)，在缺血性心肌中差異性表達的145個lncRNA中的35個顯示出與缺血程度強烈的表達有相關(guān)性。QU等［35］同樣在對心肌梗死4周后的梗死周圍區(qū)特異性表達的lncRNA和mRNA進行生物信息學分析，包括GO富集、通路和網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在由心肌梗死引起的心肌纖維中的表達具有特征性。Lorenzen等［36］研究發(fā)現(xiàn)，AKI危重患者血循環(huán)可以檢測到LncRNA，此LncRNA位于22號染色體為基因內(nèi)反義LncRNA，作者將其命名為TrAnscript Predicting Survival in AKI（TapSAKI）。TapSAKI存在于腎組織并且在AKI患者血循環(huán)中其表達上調(diào)。為了確認TapSAKI潛在的可能起源，對缺氧腎內(nèi)皮及小管上皮細胞進行檢測發(fā)現(xiàn)在三磷酸腺苷損耗的小管上皮細胞內(nèi)其表達豐富。然而，其并未對TapSAKI的釋放機制以及其在腎臟中的具體作用進一步詳細研究。Chen等［37］對腎細胞癌的臨床病理、預后，以及根據(jù)不同的LncRNAs進行診斷的方法進行了一項系統(tǒng)回顧和分析探討其臨床價值時證明，LncRNA對腎細胞癌具有高度的敏感性，顯著優(yōu)于其他的生物標志物，可以檢測早期階段淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，提示LncRNA可以成為腎細胞癌潛在的預后標志物。

基于包括以上的大量研究證明，病理組織中特異性表達的LncRNA可以通過原位調(diào)控或遠程調(diào)控對基因的表達進行調(diào)節(jié)，本課題組前期利用高通量基因測序技術(shù)，篩選出在CI-AKI大鼠的腎組織中有顯著性差異的LncRNAs，通過生物信息學軟件分析及使用定量聚合酶鏈反應（Q-PCR）方法進行驗證，最終確定研究目標基因LncRNA XLOC_036125。說明LncRNA的篩選是具有依據(jù)和可行性的。

自噬在AKI發(fā)揮重要作用，是腎細胞在發(fā)生AKI時自我保護的細胞生存途徑［8］，基于LncRNA發(fā)揮的調(diào)控作用具有空間性的特性，對同樣在腎組織中特異性表達且與LncRNA空間位置上臨近的Lgmn進行生物信息學分析，確定其生物功能與自噬相關(guān)，我們有理由推斷LncRNAXLOC_036125通過對Lgmn進行調(diào)控，發(fā)生腎損傷時對腎小管細胞的自噬活動進行調(diào)節(jié)。

4 急性腎損傷中Lgmn的差異表達

Lgmn mRNA是一種可編碼天冬酰胺酰內(nèi)肽酶的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及許多神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織中，Lgmn高度表達，且Lgmn對于細胞的增殖分化有直接作用［38］。Hinkelbein等［39］研究高氧環(huán)境下對大鼠的腎功能損傷作用和相關(guān)蛋白的表達情況時發(fā)現(xiàn)，將大鼠置于高氧的環(huán)境下一定時間后，檢測大鼠的腎臟組織中相關(guān)蛋白的表達，最后發(fā)現(xiàn)Lgmn蛋白的表達下調(diào)。Anders等［38］在研究大鼠肝臟細胞蛋白的多級自噬溶酶體處理過程中發(fā)現(xiàn)，Lgmn基因能特異性地抑制與自噬相關(guān)酶BHMT的裂解失活。Morito等［40］研究發(fā)現(xiàn)，lgmn在小鼠腎臟的近端小管細胞中高度表達，進而研究發(fā)現(xiàn)Lgmn蛋白在體外可以直接降解細胞外基質(zhì)主要成分之一的纖連蛋白。研究Lgmn對培養(yǎng)的小鼠腎臟近端小管細胞中的纖連蛋白的作用時發(fā)現(xiàn)，在Lgmn蛋白的參與下纖連蛋白的降解發(fā)生在腎臟近端小管細胞的溶酶體上，據(jù)此推測Lgmn可能在通過降解近端小管細胞外纖連蛋白從而對細胞外基質(zhì)進行重構(gòu)的過程中扮演著重要的角色。同樣，Shirahama-Noda等［41］發(fā)現(xiàn)在Lgmn蛋白缺陷小鼠腎臟細胞的溶酶體內(nèi)積累了大量的大分子，從而證明Lgmn在溶酶體的降解系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。但其在腎臟組織中的作用及機制仍不明確。本課題組前期同樣利用高通量基因測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CI-AKI大鼠的腎組織中Lgmn表達下調(diào)。

包括以上的大量研究已經(jīng)證明了Lgmn與細胞的增殖分化相關(guān)，抑制自噬相關(guān)酶的裂解失活，在體外更是能直接降解纖連蛋白，說明lgmn具有促進細胞的自噬活動。在高氧環(huán)境中，腎細胞發(fā)生氧化應激反應，此時腎細胞的調(diào)亡增加，自噬下降，也驗證了Lgmn促自噬的生物功能。

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R542.2+2

A

1007-9688（2017）06-0795-05

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.06.42

國家自然科學基金項目（項目編號：81670339）。

劉勇（1982-），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向為心內(nèi)科疾病診治。

陳紀言，E-mail：chenjiyandr@126.com；共同通信作者：譚 寧，E-mail：tanning100@126.com

2016-00-00）