陳凌舟 彭衛(wèi)華

·綜述·

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性小血管炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展

陳凌舟 彭衛(wèi)華

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic autoantibody, ANCA)相關(guān)性小血管炎(ANCA associated small vessel vasculiltis, AASV)是以中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞胞質(zhì)成分為靶抗原的一組自身免疫性系統(tǒng)性疾病，主要包括肉芽腫性多血管炎、顯微鏡下多血管炎和嗜酸性肉芽腫性多血管炎。腎臟是AASV最易受累的器官之一，病理表現(xiàn)為寡免疫節(jié)段壞死性新月體性腎小球腎炎(pauci-immune necrotizing crescentic glomerulonephritis , PI-NCGN)。其病因與發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。研究認(rèn)為，遺傳因素可能是AASV發(fā)病的基礎(chǔ)[1],而環(huán)境因素如感染、藥物以及吸入有害化學(xué)物質(zhì)等是其重要誘因[2-3]。本文就近年來髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)致病性分子表位、抗人溶酶體相關(guān)膜蛋白2(human lysosomal-associated membrane protein 2, hLAMP-2)抗體、ANCA的產(chǎn)生機(jī)制、中性粒細(xì)胞胞外補(bǔ)網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)、補(bǔ)體旁路途徑在AASV發(fā)病機(jī)制中的作用及相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

一、MPO致病性分子表位與AASV

1982年ANCA首次在節(jié)段壞死性腎小球腎炎患者血清中被發(fā)現(xiàn)[4]。隨后相繼在肉芽腫性多血管炎、顯微鏡下多血管炎、寡免疫節(jié)段壞死性新月體性腎小球腎炎、嗜酸性肉芽腫性多血管炎患者血清中檢測到ANCA[5-7]。根據(jù)間接免疫熒光法(IIF)可將ANCA染色模型分為胞質(zhì)型ANCA(cytoplasmic, C-ANCA)、核周型ANCA(perinucldar, P-ANCA)以及介于二者之間的非典型ANCA(X-ANCA)。C-ANCN的主要靶抗原為蛋白酶3(Proteinase 3, PR3)，常與肉芽腫性多血管炎相關(guān)；P-ANCN的主要靶抗原為MPO，常與顯微鏡下多血管或嗜酸性肉芽腫性多血管炎相關(guān)。此外，目前已被檢測到的中性粒細(xì)胞靶抗原還包括人白細(xì)胞彈性蛋白酶、天青殺素、防御素、乳鐵蛋白、人溶酶體相關(guān)膜蛋白2等，但目前公認(rèn)的最具有臨床意義的靶抗原仍是PR3與MPO。歐洲小血管研究中心指出IIF法聯(lián)合抗原特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測ANCA對診斷肉芽腫性多血管炎、顯微鏡下多血管炎和節(jié)段壞死性新月體性腎小球腎炎的特異度均可達(dá)到99%，而敏感度分別達(dá)73%、67%和82%[8]。胡偉新等[9]研究發(fā)現(xiàn)血清ANCA水平與血管炎的活動性相關(guān)，復(fù)發(fā)的病例均伴隨血清ANCA水平的升高, 血清ANCA持續(xù)陰性或滴度無升高者無一例復(fù)發(fā)。國外一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)ANCA滴度升高者復(fù)發(fā)率高達(dá)75%[10]。目前普遍認(rèn)為ANCA在AASV的發(fā)病機(jī)制中起核心作用，并且是診斷血管炎、判斷疾病活動性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

然而，隨著ANCA檢測的普及，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道在某些非原發(fā)性血管炎疾病中也可出現(xiàn)ANCA，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、IgA腎病等[11-14]。而臨床處于血管炎緩解期的患者血清ANCA也常保持較高的水平。此外，尚有1/3臨床確診為AASV的患者血清ANCA檢測為陰性[15]。由Roth等[16]開展的一項(xiàng)研究通過質(zhì)譜分析法確定了MPO上25個(gè)分子表位，發(fā)現(xiàn)活動性血管炎患者的抗MPO抗體只與其中一個(gè)MPO447-459表位結(jié)合，由此說明只有這部分抗體是具有致病性的。研究同時(shí)指出血漿銅藍(lán)蛋白片段可能干擾ANCA的檢測而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這或許提示了并非所有的ANCA均具有致病性，通過檢測能與MPO447-459表位結(jié)合的特異的抗MPO抗體較檢測血清總ANCA水平可能更能反映血管炎的活動程度。

二、ANCA新亞型——抗hLAMP-2抗體

抗hLAMP-2抗體作為ANCA的新亞型最早由Kain等[17]在1995年提出，其通過免疫印跡法檢測到中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞膜上能與壞死性新月體性腎小球腎炎患者ANCA陽性血清相結(jié)合的兩個(gè)蛋白片段，并證實(shí)該蛋白成分即溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP-2)。LAMP-2是一種高度糖基化的跨膜蛋白，其存在于溶酶體膜表面，不同于MPO及PR3的是，LAMP-2可穿梭于溶酶體膜與細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)可由溶酶體釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面與血清抗LAMP-2抗體結(jié)合。 LAMP-2在細(xì)胞黏附、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞自噬、抗原呈遞等方面均具有重要作用。Kain等[18]發(fā)現(xiàn)84例寡免疫節(jié)段壞死性腎小球腎炎(pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis, FNGN)患者血清中有78例(93%)存在hLAMP-2抗體，而通過免疫抑制治療后處于緩解期的患者血清抗體陽性率則明顯下降。此外，重組FimH免疫大鼠產(chǎn)生的抗FimH抗體可與人的LAMP-2交叉反應(yīng)，LAMP-2的P41-49表位與革蘭陰性菌Ⅰ型菌毛頂端的黏附素FimH具有100%同源性[19]，由此說明“感染-免疫”機(jī)制可能在AASV的發(fā)病中起重要作用。隨后歐洲的一項(xiàng)研究進(jìn)一步確證了抗LAMP-2抗體在ANCA相關(guān)性小血管炎患者中的高陽性率(陽性率為80%～90%)[19]，與Kain等[18]早先研究結(jié)果相一致。另外，經(jīng)過免疫抑制治療后抗LAMP-2抗體迅速轉(zhuǎn)陰，處于疾病緩解期患者血清中檢測不到抗LAMP-2抗體，當(dāng)疾病復(fù)發(fā)時(shí)又再度出現(xiàn)，預(yù)示其可作為反映血管炎活動性的良好標(biāo)志物。

Peschel等[20]用ELISA法檢測11例ANCA陰性的FNGN患者血清抗LAMP-2抗體，其中8例呈陽性反應(yīng)。與ANCA陽性患者不同的是，ANCA陰性患者體內(nèi)的這些抗體結(jié)合的是腎小球上分子質(zhì)量為110 000的LAMP-2，而非內(nèi)皮細(xì)胞上高度糖基化的分子質(zhì)量為190 000的LAMP-2。此為解釋ANCA陰性的FNGN的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的可能，即抗LAMP-2抗體可直接結(jié)合腎小球上的LAMP-2，而不一定要通過血液循環(huán)結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的途徑致病。

抗LAMP-2抗體在AASV患者中高表達(dá)的觀點(diǎn)亦不乏爭議。Roth等[21]通過ELISA法檢測329例ANCA相關(guān)性腎小球腎炎患者血清中僅21%出現(xiàn)抗LAMP-2抗體，而對照組104例革蘭陰性菌尿路感染患者血清中亦可檢測到16%的陽性率；ANCA陽性血清中被檢測到的抗LAMP-2抗體滴度也較抗MPO抗體和抗PR3抗體滴度低得多。故認(rèn)為抗LAMP-2抗體只在小部分AASV患者中低表達(dá)，且與疾病的活動性無關(guān)。推測LAMP-2高度糖基化的特點(diǎn)限制了抗LAMP-2抗體檢測試驗(yàn)的可重復(fù)性，且抗LAMP-2抗體檢測只在機(jī)體免疫力低下及疾病活動期時(shí)較為敏感，而Roth等[21]的入選病例包含了緩解期的AASV患者，因此抗LAMP-2抗體檢測陽性率低；此外，試劑盒抗原的不同也是造成二者實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因之一[22]。新近在皮膚結(jié)節(jié)性多動脈炎患者和過敏性紫癜患者血清中也發(fā)現(xiàn)抗LAMP-2抗體的高表達(dá)[23]，提示抗LAMP-2抗體對ANCA相關(guān)性小血管炎的診斷可能并非完全特異。因此，抗LAMP-2抗體與AASV之間的關(guān)系究竟如何，其在AASV的發(fā)病中扮演怎樣的角色，還有待進(jìn)一步深入研究。

三、ANCA的產(chǎn)生機(jī)制

關(guān)于ANCA的產(chǎn)生機(jī)制有諸多假說，其中感染與病原體分子模擬機(jī)制是近年來討論最多的假說之一。如上所述，LAMP-2與細(xì)菌黏附素FimH高度同源性基礎(chǔ)上的直接分子模擬可誘發(fā)抗LAMP-2抗體產(chǎn)生。此外，cPR3是由編碼PR3的DNA互補(bǔ)鏈所編碼的蛋白，其與某些金黃色葡萄球菌蛋白片段具有同源性，機(jī)體針對金黃色葡萄球菌免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體可與cPR3交叉反應(yīng)?？筩PR3抗體通過“獨(dú)特型-抗獨(dú)特型”機(jī)制產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體可同時(shí)與PR3產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致肉芽腫性多血管炎[24]。但目前尚無直接證據(jù)證明抗PR3抗體與細(xì)菌蛋白間存在交叉反應(yīng)，在抗PR3抗體陽性的血管炎患者中也未發(fā)現(xiàn)抗cPR3抗體的高表達(dá)[25]。因此，該分子模擬機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

病原體相關(guān)分子模式識別可能是產(chǎn)生ANCA的另一機(jī)制。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是連接非特異性免疫和特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。人類Toll樣受體家族成員現(xiàn)已確認(rèn)的有10個(gè)(TLR1～10)。機(jī)體感染病原體后，細(xì)菌上Toll樣受體配體與中性粒細(xì)胞上Toll樣受體結(jié)合，激活中性粒細(xì)胞上的TLR2與TLR9，進(jìn)而使PR3表達(dá)上調(diào)[26]。近期一項(xiàng)關(guān)于Toll樣受體基因組的研究認(rèn)為TLR9基因座的多樣性可能與肉芽腫性多血管炎的易感有關(guān)[27]。

ANCA的產(chǎn)生與遺傳因素密不可分。MPO-ANCA和PR3-ANCA分別與HLA-DQ及HLA-DP基因的多態(tài)性有關(guān)[28]。歐洲的一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究對492例肉芽腫性多血管炎患者進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)，SEMA6A和HLA-DP基因座是決定其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵基因，其中HLA-DPB1*04等位基因是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的重要組成部分[29]。雖然HLA的風(fēng)險(xiǎn)等位基因在誘發(fā)AASV自身免疫反應(yīng)中起何種作用還未明確，但在其他與HLA II類基因相關(guān)的疾病中，風(fēng)險(xiǎn)基因都定位于同一個(gè)肽結(jié)合槽中的氨基酸殘基上[30]。HLA風(fēng)險(xiǎn)基因能夠特異性地結(jié)合轉(zhuǎn)錄后肽的能力可能是誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的重要機(jī)制[31]。

四、NETs與AASV

一直以來，吞噬作用被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞殺傷病原體的主要機(jī)制，但NETs的發(fā)現(xiàn)提出了新觀點(diǎn)。NETs是中性粒細(xì)胞死亡過程中被釋放至細(xì)胞外的一種活性成分，由染色質(zhì)與抗菌蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其核心是DNA和組蛋白結(jié)合成的染色質(zhì)絲，顆粒蛋白如MPO、組織蛋白酶G、PR3等包繞與填充其間。中性粒細(xì)胞這種不同于凋亡和壞死的獨(dú)特死亡過程被命名為NETosis。當(dāng)中性粒細(xì)胞識別到較大的病原體和微生物簇時(shí)，NETs能夠被提前釋放出胞外，早于細(xì)胞的吞噬功能對病原體進(jìn)行殺傷[32]。近年大量文獻(xiàn)報(bào)道NETs與血栓的形成有關(guān)，并在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[33]。

AASV是最早被報(bào)道與NETs形成相關(guān)的自身免疫性疾病之一[34]。Kessenbrock等[34]將中性粒細(xì)胞與腫瘤壞死因子α及AASV患者純化的IgG共培養(yǎng)以致敏中性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NETs大量生成。隨后其通過免疫熒光法觀察到胞外染色質(zhì)絲上有MPO與PR3附著。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)在活動性血管炎患者血循環(huán)中存在大量MPO-DNA復(fù)合物，而NETs主要存在于有大量中性粒細(xì)胞浸潤的腎組織中，這說明NETs主要在血管炎活動時(shí)大量產(chǎn)生。Sangaletti等[35]發(fā)現(xiàn)NETs能夠與髓樣樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生相互作用，促進(jìn)后者對MPO與PR3的攝??；將與NETs共培養(yǎng)的髓樣樹突狀細(xì)胞注入健康小鼠體內(nèi)可誘發(fā)MPO-ANCA與PR3-ANCA生成，小鼠出現(xiàn)活動性腎小球腎炎。NETs與ANCA在AASV發(fā)病中的相互作用過程如下：①抗原提呈細(xì)胞攝取來自NETs上的MPO與PR3；②自身免疫性T淋巴細(xì)胞通過NETs誘發(fā)產(chǎn)生的共刺激信號來識別MPO與PR3；③活化的T細(xì)胞刺激自身免疫性B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生ANCA；④ANCA及其他一些刺激因素如金黃色葡萄球菌等進(jìn)一步誘發(fā)中性粒細(xì)胞經(jīng)歷NETosis，使NETs的生成進(jìn)一步增加。而MPO-ANCA陽性血清對NETs的降解能力下降，血清中DNA酶I活性降低以及抗NETs抗體的存在可能是導(dǎo)致NETs持續(xù)存在并與ANCA相互刺激，造成AASV組織損害持續(xù)進(jìn)展的惡性循環(huán)的原因[36]。

五、補(bǔ)體旁路途徑在AASV中的作用

既往普遍認(rèn)為AASV的腎臟損害具有寡免疫的特性，但越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)在AASV的腎臟病理組織中存在補(bǔ)體的沉積[37-39]。補(bǔ)體旁路途徑的激活與完整的C5a受體可能是使血管炎小鼠模型發(fā)生腎小球腎炎的必要條件[40-41]。Yuan等[42]研究發(fā)現(xiàn)活動性血管炎患者血清補(bǔ)體C5a水平顯著高于疾病緩解期患者、狼瘡腎炎患者及正常對照組補(bǔ)體；受體CD88在活動性AASV患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，與之相反的是C5L2的表達(dá)則上調(diào)。補(bǔ)體C5a與中性粒細(xì)胞上的受體CD88結(jié)合后能夠進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞。在腎缺血-再灌注模型中，C5a與腎小管上皮細(xì)胞上的CD88受體結(jié)合后誘發(fā)的局部炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂及腎功能下降。由此推測，AASV患者腎組織內(nèi)CD88表達(dá)下調(diào)可能是C5a介導(dǎo)的內(nèi)化作用的結(jié)果，這是一種自我保護(hù)機(jī)制，能夠減輕補(bǔ)體C5a引起的免疫損傷。受體C5L2被認(rèn)為能夠競爭性抑制補(bǔ)體C5a與CD88的結(jié)合，從而減輕C5a引發(fā)的免疫損傷。因中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上均有C5L2的表達(dá)，所以受體C5L2在AASV患者腎組織中表達(dá)上調(diào)在某種程度上能夠反映腎小球炎癥浸潤的程度。Gou等[43]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bb因子作為補(bǔ)體旁路途徑活化的標(biāo)志物，其在腎臟的沉積程度與腎組織中新月體數(shù)、間質(zhì)浸潤、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮程度呈正相關(guān)；疾病活動期患者尿液中Bb因子、C3a、C5a、可溶性膜攻擊復(fù)合物C5b-9的水平均顯著高于緩解期患者；活動性血管炎患者尿液中Bb因子水平與血肌酐成正比，推測補(bǔ)體旁路途徑活化在ANCA相關(guān)性小血管炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

體外實(shí)驗(yàn)也表明受ANCA活化的中性粒細(xì)胞能夠激活補(bǔ)體從而使PR3在細(xì)胞表面的表達(dá)上調(diào)[44]。此外，一項(xiàng)小樣本的基因組研究發(fā)現(xiàn)由同基因編碼的補(bǔ)體C3的變體C3F在AASV患者中存在高表達(dá)[45]。推測受ANCA活化的中性粒細(xì)胞促進(jìn)補(bǔ)體旁路途徑的激活，由此產(chǎn)生大量C5a與中性粒細(xì)胞上的受體結(jié)合，而后活化的中性粒細(xì)胞通過反饋回路進(jìn)一步激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使炎癥過程得以持續(xù)。補(bǔ)體C5a抑制劑Eculizumab(依庫麗單抗)則可望成為治療血管炎的新型藥物。

六、結(jié)語

綜上所述，近年來對ANCA相關(guān)性小血管炎的研究取得了較大的進(jìn)展。中性粒細(xì)胞靶抗原表位的特異性部分解答了人們對ANCA致病性的困惑；hLAMP-2抗體的發(fā)現(xiàn)及LAMP-2與細(xì)菌黏附素FimH的高度同源性啟示病原體分子模擬機(jī)制在AASV發(fā)病中的意義；中性粒細(xì)胞在死亡過程中釋放NETs可能是包括ANCA相關(guān)性小血管炎在內(nèi)的諸多自身免疫性疾病發(fā)病的共同環(huán)節(jié)；而補(bǔ)體旁路途徑在AASV發(fā)病中的作用已被提升到相當(dāng)重要的高度。雖然AASV的發(fā)病機(jī)制目前仍存在不少待解問題，但AASV相關(guān)致病基因以及分子水平的深入研究，必將有助于AASV的診斷、判斷病情活動性及免疫抑制劑的個(gè)體化治療。

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10.3969/j.issn.1671-2390.2017.03.012

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