劉秀麗，呂 紅，范小峰

(1.隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽745000；2.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅慶陽745000；3.慶陽市疾病預(yù)防控制中心，甘肅慶陽745000)

兩種茄科植物基因組提取方法的比較

劉秀麗1,2，呂 紅3，范小峰1,2

(1.隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽745000；2.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅慶陽745000；3.慶陽市疾病預(yù)防控制中心，甘肅慶陽745000)

以番茄和馬鈴薯的幼葉、嫩莖組織作為實(shí)驗(yàn)材料，使用CTAB提取DNA法、SDS法和尿素提取法提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)基因組提取效果，篩選出適合不同組織的最優(yōu)基因組提取方法。結(jié)果表明，采用不同的方法提取植物基因組DNA的質(zhì)量不同而差異很大，CTAB法提取植物葉片基因組效果較好，SDS法提取植物嫩莖基因組效果較好，而尿素法提取效果均不佳。基因組提取方法的篩選與改良為這兩種茄科作物的分子研究奠定了基礎(chǔ)。

植物基因組；CTAB法；SDS法；尿素法；瓊脂糖凝膠電泳

在茄科作物中，番茄(SolanumlycopersicumL.)和馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是人們經(jīng)常食用的蔬菜，也是全球人類主要的糧食作物，無論是其具有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還是美味的口感都深受人們喜愛。番茄和馬鈴薯均含有大量的維生素和很多種人體必需的微量元素，番茄有清熱消暑、生津止渴、健胃消食等功效[1-2]，馬鈴薯是世界第四大作物，它營(yíng)養(yǎng)豐富，具有益氣調(diào)中、健脾和胃、減肥瘦身及消除疲勞等功效[2-3]。目前針對(duì)這兩種農(nóng)作物的研究非常多，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，植物的研究也在向微觀方向轉(zhuǎn)移，而基因組DNA的提取就成為了對(duì)作物進(jìn)行分子研究的基礎(chǔ)問題及必經(jīng)環(huán)節(jié)。因此，針對(duì)這兩種茄科作物，尋找一種有效的、快速的DNA提取方法非常必要。

目前，對(duì)植物基因組總DNA的提取方法有很多種，如堿裂解法、CTAB法、SDS法、低pH值法、試劑盒法、尿素法等，SDS法和CTAB法是這些方法中最為常用、相比較也最為經(jīng)濟(jì)的方法[4]。其中SDS法根據(jù)的是SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R-復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)變性而沉淀的原理，因此可通過SDS的作用，使膜蛋白溶解而破壞細(xì)胞膜。CTAB法是利用陽離子表面活性劑CTAB，在低離子強(qiáng)度溶液中可沉淀核酸和酸性多聚物，高離子強(qiáng)度溶液中又可與蛋白質(zhì)等多聚物形成復(fù)合物。三種DNA提取方法在技術(shù)手段上類似，其中SDS法和CTAB法是通過表面活性劑的作用裂解細(xì)胞，尿素提取法是利用尿素(carbamide)的水解作用裂解細(xì)胞，待細(xì)胞裂解后，釋放內(nèi)容物，均用苯酚、氯仿—異戊醇等有機(jī)溶劑多次反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)多糖等變性后沉淀于有機(jī)相中[5]68，把親水性強(qiáng)的核酸分子留在水相，從而達(dá)到分離核酸的目的。其中尿素法作用比較溫和，不需要?jiǎng)×艺鹗幒透邷靥幚砬液?jiǎn)單易行，在細(xì)菌、真菌的基因組提取中均有相關(guān)報(bào)道。另外，對(duì)于含有次生代謝產(chǎn)物如多酚、多糖、脂質(zhì)、單寧等較高的植物，在DNA提取過程中通常需要添加一些能保護(hù)DNA免受多酚氧化酶、醌類等物質(zhì)損害的還原性較強(qiáng)的抗氧化劑，相對(duì)而言，能在一定程度下使DNA的質(zhì)量得以提高；如果所選的材料中含有蛋白質(zhì)較高，為了降低蛋白質(zhì)的污染，通常多次使用氯仿—異戊醇進(jìn)行抽提[5]68。

本研究以番茄和馬鈴薯的不同組織作為材料，用CTAB法、SDS法、尿素提取法分別提取基因組DNA，比較并篩選針對(duì)某一組織的最優(yōu)方法，從而為以后能更高效地提取植物基因組DNA提供理論實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用番茄和馬鈴薯的嫩莖和嫩葉作為材料，均取自隴東學(xué)院生農(nóng)科技園。

SDS、CTAB、尿素、氯仿、異戊醇、苯酚、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、EDTA、Tris均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法[6]

①稱取預(yù)處理的新鮮植物葉片或嫩莖約0.2g于研缽中低溫研磨至粉末狀后，快速轉(zhuǎn)入2ml離心管中，立刻加入0.7ml65℃預(yù)熱的含2%CTAB的提取緩沖液(2%CTAB，100mmol/lTris-HCl，20mmol/l EDTA，1.4mol/l NaCl，2%β-巰基乙醇，pH值8.0)，反復(fù)顛倒搖勻，于65℃水浴加熱40min，期間每隔10min左右搖動(dòng)1次，充分混合樣品與提取液。

②等待樣品冷卻至室溫后在通風(fēng)廚中加入0.9ml的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V=25/24/1)，反復(fù)顛倒呈乳狀液為止，室溫下12000rpm，離心10min。

③吸上清液于新的離心管中，加入0.7ml氯仿/異戊醇(V/V=24/1)輕搖混勻，室溫下12000rpm，離心10min。此步驟根據(jù)情況可重復(fù)1～2次。

④加入50μl 3M NaAc(pH值5.2)溶液，輕搖混勻后，加入1ml預(yù)冷(-20℃)的異丙醇混勻，置-20℃冰箱1h。4℃下12000rpm，離心15min，棄上清液。

⑤用75%乙醇洗沉淀2次，自然風(fēng)干DNA。

⑥D(zhuǎn)NA干燥后，加入50μl TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH8.0)和0.5μl RNase A(10mg/ml)并于37℃恒溫消化RNA 2h，置4℃冰箱1d，然后保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 SDS法[7]

①稱取預(yù)處理的新鮮植物葉片或嫩莖約0.2g于研缽中低溫研磨至粉末狀后，快速轉(zhuǎn)入2ml離心管中，加入0.8ml 65℃預(yù)熱的含1.5% SDS的提取緩沖液(500mmol/l NaCl，100mmol/l Tris-HCl，50mmol/l EDTA，1.5%SDS，2%β-巰基乙醇，pH8.0)，于65℃水浴中加熱40min，中間每隔約10min搖動(dòng)一次，使提取液與樣品充分混合。

②加入200μl 5M KAc溶液后，劇烈震蕩，冰浴20min。

③4℃下12000rpm離心10min，吸取上清液并加入0.8ml酚/氯仿/異戊醇(V/V/V=25/24/1)，反復(fù)顛倒呈乳狀液為止，4℃下12000rpm，離心10min，根據(jù)情況重復(fù)此步驟1～2次。

④移取上清液，加入1ml預(yù)冷(-20℃)無水乙醇，沉淀1h。12000rpm，離心10min，丟棄上清液。

⑤用75%乙醇洗DNA沉淀2次，自然風(fēng)干。

⑥待DNA干燥后，加入50μl TE緩沖液和0.5μl RNase A于37℃恒溫放置2h后，然后保存于冰箱-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 尿素法[8]

①稱取預(yù)處理的新鮮植物葉片或嫩莖約0.2g于研缽中低溫研磨至粉末狀后，快速轉(zhuǎn)入2ml離心管中，加入約20μl β-巰基乙醇和0.8ml含7mol/l尿素的裂解緩沖液(7mol/l尿素、500mmol/l NaCl、50mmol/l Tris-HCl，pH值8.0)，并混合均勻。

②于通風(fēng)櫥中加入0.9ml的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V=25/24/1，反復(fù)顛倒至乳狀液為止，室溫下12000rpm，離心10min。

③吸取上清，加入0.3ml 10mol/l NH4AC混合均勻。

④加入1ml預(yù)冷的無水乙醇，輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，直到形成絮狀核酸沉淀，室溫下12000rpm，離心10min。

⑤用75%乙醇洗DNA沉淀2次，自然風(fēng)干，加入0.5mlTE緩沖液(pH值8.0)溶解。

⑥待核酸完全溶解后，加入約0.5μl RNA酶(10mg/ml)，于37℃恒溫保持約1h，最后于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法[9]

①制膠(1%瓊脂糖凝膠)：清洗好膠模并架好梳子，稱取0.2g瓊脂糖，加入20ml1倍的TAE緩沖液，在微波爐上加熱熔化至無顆粒澄清透明狀，取出待其冷卻至50～60℃后，加入1μl核酸染料，搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待20分鐘左右膠完全凝固后放入已倒入適量1×TAE緩沖液的電泳槽，拔去梳子備用。

②加樣：取5μl提取的DNA樣品，與1μl 6×電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。

③電泳：一組樣加完后，蓋上槽蓋，接通電源，使電壓調(diào)制80V，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距加樣孔到整塊凝膠的三分之二處時(shí)，停止電泳。

④觀察和拍照：取出膠塊放置于紫外燈下觀察，DNA可顯示出肉眼可辨的橘黃色熒光帶，再用凝膠成像儀拍照，以便分析保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物葉片基因組的提取結(jié)果

采用CTAB法、SDS法、尿素法分別對(duì)番茄和馬鈴薯幼嫩葉片的基因組進(jìn)行提取，最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1～圖4)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。結(jié)果表明，CTAB法提取的兩種植物葉片的基因組，平均濃度達(dá)1.9mg/ml，SDS法提取的葉片基因組，平均濃度約0.8mg/ml，尿素法對(duì)個(gè)別樣品沒有明顯條帶，DNA濃度均在0.2mg/ml以下。因此，針對(duì)馬鈴薯、番茄葉片組織，CTAB法效果最佳，尿素法提取效果最差。

圖1 番茄葉片基因組提取的結(jié)果注：1～3：CTAB法；4～6：SDS法；7～9：尿素法

圖2 CTAB法提取番茄葉片基因組的結(jié)果注：1～8：CTAB法提取番茄葉片DNA

圖3 馬鈴薯葉片基因組的提取結(jié)果注：1～2：CTAB法；3～4：SDS法；5～6：尿素法

圖4 CTAB法提取馬鈴薯葉片基因組的結(jié)果注：1～11：CTAB法提取馬鈴薯葉片DNA

2.2 植物嫩莖基因組的提取結(jié)果

采用CTAB法、SDS法、尿素法分別對(duì)番茄和馬鈴薯嫩莖進(jìn)行基因組提取，最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖5～圖8)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。結(jié)果表明，CTAB法提取的兩種植物嫩莖的基因組，平均濃度達(dá)0.4mg/ml最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SDS法提取的嫩莖基因組，平均濃度約0.8mg/ml，尿素法對(duì)嫩莖提取的基因組，DNA濃度均在0.3mg/ml左右，但電泳條帶彌散，有雜帶，并且測(cè)得OD260/OD280比值均小于1.023，說明有較多的蛋白質(zhì)污染。因此，在植物嫩莖基因組的提取中SDS法效果最佳，而尿素法效果最差。

圖5 番茄嫩莖基因組的提取結(jié)果注：1～2：CTAB法；3～5：SDS法；6～7：尿素法

圖6 SDS法對(duì)番茄嫩莖基因組的提取結(jié)果注：1～7：SDS法提取番茄嫩莖基因組DNA

圖7 馬鈴薯嫩莖基因組的提取結(jié)果注：1～2：CTAB法；3～5：SDS法；6～8：尿素法

圖8 SDS法對(duì)馬鈴薯嫩莖基因組的提取結(jié)果注：1～6：SDS法提取馬鈴薯嫩莖基因組DNA

3 討論

對(duì)于在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究來說，基因組總DNA的提取是分子生物學(xué)研究開展的基礎(chǔ)。只有獲得高質(zhì)量的基因組DNA，才能更好地進(jìn)行后續(xù)的分子操作，包括分子雜交、基因克隆、酶切、PCR擴(kuò)增以及遺傳多態(tài)性分析等很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)[10-11]。隨著在農(nóng)作物中對(duì)番茄和馬鈴薯的研究越來越多，并且逐漸向微觀發(fā)展，對(duì)這兩種植物組織的基因組DNA提取方法的改良也尤為重要。本研究采用CTAB法、SDS法、尿素法對(duì)兩種茄科植物不同組織進(jìn)行基因組DNA提取，三種方法的區(qū)別在于裂解液不同，即分別在裂解液中加入CTAB、SDS和尿素，但其它后續(xù)試劑差別不大，都是利用EDTA鰲和金屬離子鎂離子防止脫氧核糖核酸酶降解DNA、Tris-HCl作為緩沖劑為DNA提供穩(wěn)定的pH值體系，NaCl增加體系中的鹽強(qiáng)度，破壞細(xì)胞以后在苯酚、氯仿、異戊醇的作用下抽提DNA，沉淀細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)及多糖，再于預(yù)冷乙醇中使核酸沉淀。研究過程中為了獲得更好的提取方法，反復(fù)試驗(yàn)試劑的添加量、有機(jī)溶劑的萃取次數(shù)以及萃取時(shí)間，從而使提取的DNA的雜質(zhì)更少。最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)獲得針對(duì)特定組織的最優(yōu)方法；針對(duì)茄科植物葉片的基因組提取，CTAB法更優(yōu)；針對(duì)茄科植物嫩莖基因組的提取，SDS法更優(yōu)。

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【責(zé)任編輯 趙建萍】

A Comparison on the Methods for Genome Extraction on Two Plant Species of Solanaceae

LIU Xiu-li1, 2, LV Hong3, FAN Xiao-feng1, 2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu; 2.UniversityProvincialKeyLaboratoryforProtectionandUtilizationofLongdongBio-resourcesinGansuProvince,Qingyang745000,Gansu; 3.QingYangCenterforDiseasesPreventionandControl,GansuProvince,Qingyang745000,Gansu)

Using CTAB method, SDS and urea method ion, plant leaves, roots and other organizations were taken as materials to extract genomic DNA. A method which is the best genome extraction for given organization was picked out by agarose gel electrophoresis. The results show that the quality of extracted genomic DNA by different methods was very different. Compared with the three methods, CTAB method to extract genome is better for plant leaves, SDS method is better for plant spears, and relatively urea method is not good for the plant tissues. It lays foundation for molecular research of two plant species of Solanaceae to improve extraction method of genome.

plant genome; CTAB method; SDS method; Urea method; Agarose gel electrophoresis

1674-1730(2017)01-0053-04

2016-09-26

甘肅省慶陽市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目《幾種球根花卉的引種繁殖及栽培示范》(KZ2015-12)；甘肅省慶陽市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目《石油殘留物中重金屬對(duì)動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響》(KZ2012-78)

劉秀麗(1979—)，女，滿族，河北承德人，講師，碩士，主要從事植物分子及生理研究。

Q781

A