王 妍，王亞濤

(隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅慶陽745000)

磁性微球的制備及其在分離純化生物大分子中的應(yīng)用

王 妍，王亞濤

(隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅慶陽745000)

磁性微球是一種新型的功能化材料，因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用在環(huán)境工程、生物醫(yī)學(xué)工程、生化分離和細(xì)胞生物學(xué)等諸多領(lǐng)域。而磁性微球的研究現(xiàn)狀以及未來的發(fā)展趨勢(shì)表明，如何開發(fā)出粒度比較均勻、懸浮穩(wěn)定性好、磁響應(yīng)性強(qiáng)和表面富含多種活性功能基團(tuán)的磁性微球?qū)⑹墙窈笤擃I(lǐng)域的一個(gè)研究重點(diǎn)。

磁性微球；分離；純化；生物大分子

磁性微球是由磁性納米粒子與含有各種活性功能基團(tuán)的高分子材料復(fù)合而形成的具有特殊表面結(jié)構(gòu)和功能團(tuán)的微球。對(duì)于磁性微球的研究最早開始于20世紀(jì)70年代，而我國對(duì)它的研究從20世紀(jì)80年代開始才日漸活躍。這種磁性微球本身具有很多優(yōu)點(diǎn)，其最顯著的兩個(gè)特點(diǎn)是：(1)磁性微球具備良好的順磁性，在外加磁場下能被其吸引，但在撤消掉外加磁場后又能夠很好地分散；(2)磁性微球具有高分子粒子的特性，通過化學(xué)聚合和表面改性，可以使其表面含有多種具有生物活性的官能團(tuán)(如-OH、-NH2、-COO等)和生物活性物質(zhì)(如：抗體、酶、蛋白質(zhì)等)。作為新型的功能化材料，磁性微球在生物醫(yī)學(xué)、生物工程和環(huán)境工程等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和潛力，已引起了各國研究者的高度重視，成為日前生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域中研究最熱門的課題。本文主要從磁性微球的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)、制備方法以及在生化分離中的應(yīng)用等幾個(gè)方面論述了近年來國內(nèi)外對(duì)磁性微球的研究現(xiàn)狀。

1 磁性微球的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

1.1 磁性微球的結(jié)構(gòu)

A,B. Core-shell C. mix-up D. multiple laye圖1 磁性微球的分類

根據(jù)磁性納米粒子與含有各種活性功能基團(tuán)的高分子材料形成時(shí)的方式不同，磁性微球通?？煞譃槿悾汉藲ば?，包括磁性核型(圖1A)、磁性殼型(圖1B)，混合型(圖1C)和多層型(圖1D)。

1.2 磁性微球的特點(diǎn)

磁性微球作為一種分離材料載體具有以下特點(diǎn)：(1)粒徑小，比表面積大，易在溶液中分散，且對(duì)被分離物質(zhì)的吸附量大；(2)具有良好的順磁性和磁響應(yīng)性，在外加磁場的作用下易實(shí)現(xiàn)固-液分離；(3)易于進(jìn)行表面改性，可在其表面鍵合多種活性基團(tuán)，如-OH、-COOH、-NH2、-CONH2等，這些基團(tuán)容易與生物活性物質(zhì)(酶、抗體、核酸等)連接，具有良好的生物相容性[1]。

1.3 磁性微球的生物相容性

生物相容性是指將一些非活性材料植入生命體組織后，它與生命體的相容程度，也就是說植入的這些非活性材料是否會(huì)對(duì)生命體組織產(chǎn)生毒害作用。而磁性微球作為輸送藥物的載體，它在臨床研究中其自身的生物相容性和安全性已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。何秋星[2]等采用乳化交聯(lián)法制備了5-氟尿嘧啶磁性殼聚糖微球，并通過四噻唑藍(lán)法、溶血實(shí)驗(yàn)、血常規(guī)實(shí)驗(yàn)以及植埋實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了該磁性微球的細(xì)胞毒性和組織相容性，結(jié)果顯示該磁性微球具有很好的生物相容性。Shouhu Xuan[3]等制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的單分散的磁性微球，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該微球既可以用于藥物的輸送又可作為一種磁共振成像的造影劑。Jing Sun[4]等分別制備了油酸鈉包覆的磁性微球和聚乙二醇包覆的磁性微球，并對(duì)這兩種磁性微球進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示油酸鈉包覆的磁性微球具有較好的磁性和生物相容性。

2 磁性微球的制備

磁性微球是由磁性粒子與含有各種活性功能基團(tuán)的高分子材料復(fù)合而形成的，目前常用的磁性粒子主要有鐵的氧化物(Fe3O4、γ-Fe2O3)[5,6]、金屬合金(FePt、CoPt3)[7,8]、尖晶石型的磁鐵物質(zhì)(MgFe2O4、MnFe2O4、CoFe2O4)[9]等。其中Fe3O4是應(yīng)用最廣泛的磁性粒子，因?yàn)樗苋菀自谒芤褐型ㄟ^化學(xué)共沉淀的方法制備，其粒子形狀、粒度大小以及組成也可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件而得到控制。目前文獻(xiàn)報(bào)道的磁性微球的制備方法主要有包埋法、聚合法、浸漬法和生物合成法等。

2.1 包埋法

此方法是以Fe3O4納米粒子為核心，將其分散在高分子溶液中，通過氫鍵、配位鍵、共價(jià)鍵、范德華力等作用而形成高分子溶液包被Fe3O4納米粒子的磁性微球。安小寧等[10]用殼聚糖直接包埋磁粉的方法，制備出了具有高磁性的殼聚糖磁性微球，研究了磁粉與殼聚糖用量的比例對(duì)殼聚糖磁性微球的磁性的影響，結(jié)果顯示殼聚糖磁性微球的磁性與殼聚糖的用量成反比。利用包埋法制備磁性微球的優(yōu)點(diǎn)在于其操作方法簡單，其缺點(diǎn)在于制備出的磁性微球形狀不規(guī)則、大小難控制且粒徑分布范圍較寬，因此在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。

2.2 聚合法

此方法應(yīng)用比較廣泛，主要包括懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法以及活性/可控自由基聚合法等。它是在乳化劑、引發(fā)劑以及穩(wěn)定劑存在的情況下，單體直接在磁性粒子的表面發(fā)生聚合反應(yīng)而形成磁性微球。

2.2.1 懸浮聚合法

懸浮聚合法是一種比較常用的制備磁性微球的方法。王勝林等[11]將表面經(jīng)過改性處理后的Fe3O4磁性納米粒子分散到苯乙烯中，形成苯乙烯磁流體，在苯乙烯磁流體中加入引發(fā)劑和交聯(lián)劑，經(jīng)乳化后進(jìn)行微懸浮聚合，成功制備了粒徑為0.7～2.0μm的磁性微球。薛屏等[12]以甲酰胺為分散劑，通過反相懸浮聚合的方法，制備出了粒度分布較窄，且表面帶環(huán)氧基的親水性磁性復(fù)合微球。金鳳等[13]也采用懸浮聚合的方法，成功制備了平均孔徑為40nm，且表面帶環(huán)氧功能基團(tuán)的多孔性磁性復(fù)合微球。但是利用懸浮聚合法制備磁性微球時(shí)，最主要的缺點(diǎn)就是所制得的微球往往具有較寬的粒徑分布。

2.2.2 分散聚合法

使用分散聚合法可制備粒徑比較大的磁性微球，此種微球在被用于細(xì)胞分離、固定化酶等領(lǐng)域時(shí)，具有在外加磁場的作用下快速得到分離的優(yōu)點(diǎn)。王凱等[14]將聚乙二醇(PEG)和十二烷基磺酸鈉(SDS)包裹的Fe3O4磁流體加入到以乙醇/水為分散介質(zhì)，聚乙二醇為穩(wěn)定劑，過氧化苯甲酰為引發(fā)劑，苯乙烯為單體，二乙烯苯為交聯(lián)劑的分散聚合體系中，成功制備出了粒徑為300～500μm的大粒徑磁性復(fù)合微球。Ma[15]等采用分散聚合法以油酸改性的Fe3O4磁性納米粒子為基體，制得了平均粒徑約為1μm，具有超順磁性的無孔磁性復(fù)合微球。袁定重等[16]在乙醇/水分散介質(zhì)中，以聚乙烯吡咯烷酮為穩(wěn)定劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，苯乙烯和甲基丙烯酸為共聚單體，將納米級(jí)的Fe3O4粒子制成了單分散性較好、且呈微米級(jí)的P(St/MAA)磁性復(fù)合微球。

2.2.3 乳液聚合法

乳液聚合法可細(xì)分為種子乳液聚合法、無皂乳液聚合法和細(xì)乳液聚合法等，是目前研究的最多、應(yīng)用最廣泛的一種方法。龔濤[17]等采用兩步乳液聚合的方法成功制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4/P(MMA/DVB)(core)-P(St/GMA/DVB)(shell)磁性復(fù)合微球。首先他采用細(xì)乳液聚合法制備了Fe3O4/P(MMA/DVB)核，然后在通過種子乳液聚合法制備具有核-殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球，即以第一步制備的Fe3O4/P(MMA/DVB)核為種子，以苯乙烯為單體，二乙烯苯(DVB)為交聯(lián)劑，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為引發(fā)劑，使種子再次進(jìn)行聚合反應(yīng)而制得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合微球的磁含量可控制在20wt%～76wt%之間。獨(dú)俊紅等[18]采用無皂乳液聚合法在Fe3O4磁流體的存在下，成功制備出了苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)-甲基丙烯酸-β羥乙酯/Fe3O4三元共聚物磁性復(fù)合微球。該磁性復(fù)合微球Fe3O4含量可達(dá)19.80%，具有良好的超順磁性。

2.2.4 活性/可控自由基聚合法

活性/可控自由基聚合法主要包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)和1,1-二苯基乙烯法(DPE)。與其他聚合方法相比，原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)有兩個(gè)顯著特點(diǎn)：(1)在合成過程中可以控制聚合物分子的分子量和分子量分布情況；(2)其合成方式不僅僅局限于本體溶液中，在懸浮液、乳液、超臨界流體中均可以進(jìn)行聚合反應(yīng)，并能實(shí)施端基的功能化。Vestal等[19]利用ATRP技術(shù)成功制備出了平均粒徑小于15nm、表面潔凈并具有超順磁性的核殼式MnFe2O4/PS復(fù)合微球。在2001年BASF公司首次提出了1,1-二苯基乙烯(DPE)。1,1-二苯基乙烯分子中含有兩個(gè)苯環(huán)，能形成共軛體系，這使得所生成的自由基非常穩(wěn)定。此外，在DPE自由基聚合過程中，1,1-二苯基乙烯還起到了調(diào)節(jié)分子量的作用。張和鵬等[20]以Fe3O4磁性納米粒子為基體，成功地利用DPE法制備出了磁含量較高、微球大小均勻，平均粒徑為265nm且不含其它雜質(zhì)的磁性復(fù)合微球。

2.3 浸漬法

浸漬法也稱原位法。它是將已經(jīng)合成好的高分子多孔復(fù)合微球浸漬在含有Fe2+和Fe3+離子(或其他金屬離子)的混合液中，然后加入強(qiáng)堿，使在高分子多孔復(fù)合微球中形成磁性金屬氧化物納米粒。早在1988年Ugelstad等[21]就把原位法應(yīng)用到磁性高分子多孔復(fù)合微球的制備中，并相繼開發(fā)了一系列商品化磁性微球，該微球已廣泛地應(yīng)用到很多領(lǐng)域。利用浸漬法制備的磁性復(fù)合微球表面常有一些裸露的金屬離子，使得磁性微球在某些特定的應(yīng)用中受到限制，這是該方法主要的缺點(diǎn)。

2.4 生物合成法

一些生物體如磁性細(xì)菌(水生螺菌、嗜膽球菌等)，它在沿著地球磁力線遷移時(shí)，能夠在自身體內(nèi)合成出生物膜包被的磁性微球[22]。通過對(duì)這些磁性細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和修飾，就可得到大量的粒徑均勻的細(xì)菌磁性微球，這是利用生物合成法制備磁性微球的一種方法。另一種方法是利用仿生學(xué)的方式，以具有籠狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為反應(yīng)介質(zhì)，加入亞鐵鹽水溶液進(jìn)行氧化，就可得到具有磁性的納米微球。馬脾鐵蛋白是一種具有籠狀結(jié)構(gòu)的蛋白，其內(nèi)部有一個(gè)8nm可容納鐵的空腔，通過在該蛋白溶液中滴加含F(xiàn)e2+的水溶液，進(jìn)行部分氧化后就可得到紅棕色的磁性納米微球[23]。利用生物合成法制備的磁性微球粒徑分布均勻，微球間不相互聚集且無細(xì)胞毒性，在醫(yī)學(xué)界有著很大的應(yīng)用價(jià)值。但磁性細(xì)菌的培養(yǎng)條件和生物合成反應(yīng)所需要的條件均比較高，難以掌控且產(chǎn)量低，這是該方法最大的局限性。

3 磁性微球的應(yīng)用

磁性微球因其具有良好的超順磁性，在外加磁場下很容易實(shí)現(xiàn)液—固分離，其操作簡單，可省去過濾、離心等繁雜的操作，因此在生物大分子的分離純化中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 蛋白質(zhì)的分離純化

磁性微球經(jīng)過表面改性后可鍵合能被目標(biāo)蛋白識(shí)別且特異性結(jié)合的配基，當(dāng)在分離含有目標(biāo)蛋白的提取液時(shí)，目標(biāo)蛋白與含該配基的磁性微球緊密結(jié)合而從提取液中分離出來，然后在外加磁場的作用下，釋放出目標(biāo)蛋白從而達(dá)到分離純化蛋白的目的。與傳統(tǒng)的蛋白分離純化方法相比，該方法避免了在分離純化過程中目標(biāo)蛋白的損失，具有操作簡單、便捷快速、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。Zhang等[24]成功制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的三(羥甲基)氨基甲烷磁性微球，該磁性微球具有很高的磁響應(yīng)性，對(duì)溶菌酶的吸附可達(dá)到108.6mg/g，利用此磁性微球可從雞蛋清中提取出純度高、活性達(dá)8140U/mg的溶菌酶。Hu等[25]將蛋白質(zhì)G鍵合到Fe3O4@SiO2磁性微球表面，然后用此復(fù)合微球?qū)γ庖咔虻鞍走M(jìn)行了富集分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)合微球?qū)γ庖咔虻鞍椎奈搅靠蛇_(dá)41mg/g。

3.2 固定化酶

酶是一類具有生物催化作用的蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)的新陳代謝方面起著至關(guān)重要的作用。在常規(guī)的提取分離中，酶的活性和穩(wěn)定性容易遭到破壞，而導(dǎo)致酶失活，使其喪失生物催化作用。因此，為了防止在分離純化過程中酶的失活，固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。而磁性微球因其具有良好的生物相容性，在被作為酶固定的新型載體。Tiantian Tang[26]等在經(jīng)氨基化修飾的磁性復(fù)合微球上固定了血紅蛋白，然后利用該微球成功地從溶液中分離提取出了雙酚A。Marsza[27]等將人血清白蛋白(HSA)固定在磁性微球上，成功制備了人血清白蛋白固定化磁性微球，研究小分子藥物與人血清白蛋白(HSA)的親和能力。

3.3 核酸的分離

傳統(tǒng)的核酸分離技術(shù)要經(jīng)過沉淀、離心等步驟，其步驟繁雜、耗時(shí)長、含有有毒試劑，且收率低。而采用磁分離技術(shù)就可以有效地克服這些缺點(diǎn)，其分離原理基于堿基配對(duì)原則，通過在磁性微球上鍵和與目標(biāo)核酸堿基互補(bǔ)的核酸鏈而使目標(biāo)核酸達(dá)到分離。Oster[28]等利用聚乙烯醇磁性復(fù)合微球從不同血樣中成功提取出了基因組DNA，突顯出了該方法簡單、快速、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。

3.4 細(xì)胞分離

磁性微球作為一種不溶性的功能化載體，可在其表面修飾一些具有生物活性功能的吸附劑或其它配基(如抗體，外源凝集素等)。在特定條件下，被修飾的磁性微球能被目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別并發(fā)生特異性結(jié)合，而在外加磁場的作用下，又能釋放出目標(biāo)細(xì)胞，從而達(dá)到分離細(xì)胞的目的。Josephson[29]制備出了戊二醛活化硅烷包覆的磁性微球，然后利用此微球成功地從人血清中分離出了淋巴細(xì)胞；劉天孚等[30]用羧基修飾的磁性復(fù)合微球分離出了細(xì)胞純度高達(dá)94%的CD4細(xì)胞。

圖2 用磁性微球分離細(xì)胞

3.5 靶向給藥

靶向給藥又稱定位釋放藥物，即把藥物直接定向釋放在靶區(qū)，使靶區(qū)的藥物濃度比正常機(jī)體組織的濃度高，從而減少藥物的用量，增強(qiáng)藥物對(duì)靶組織的特異性，提高治療效果。磁性微球在通過表面改性后可載送藥物，在外加磁場作用下將藥物載送至靶區(qū)，實(shí)現(xiàn)靶向給藥的功能。李瑞歌[31]等制備了β-環(huán)糊精/丁二酸酐共聚磁性復(fù)合微球，以水楊酸作為模型藥物，對(duì)微球載藥的體外釋藥性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該微球可以用作藥物緩控釋系統(tǒng)的良好載體。王文[32]等人制備了磁性萬古霉素復(fù)合微球，當(dāng)把該復(fù)合微球靜脈注射在大鼠體內(nèi)后，在外加磁場的作用下這些微球聚集在病灶區(qū)，能有效地抑制大鼠的急性骨感染。

3.6 免疫分析

磁性微球在免疫分析中的應(yīng)用，就是對(duì)磁性微球的表面進(jìn)行修飾，使其表面偶聯(lián)上抗體(抗原)，然后從生物樣品中分離純化出目標(biāo)抗原(抗體)，該方法簡便、快速，適用于大批量物質(zhì)的分析檢測。Yu Cao[33]等在磁性纖維素基質(zhì)的復(fù)合微球表面偶聯(lián)抗-干擾素α-2b單克隆抗體，用來從粗的細(xì)胞裂解液中分離純化干擾素α-2b，結(jié)果表明可分離純化出純度為92.9%，活性回收率為88.5%，特定抗病毒活力為2.7×108IU/mg的干擾素α-2b。

4 展望

磁性微球因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(磁響應(yīng)性高、生物相容性好、可循環(huán)再利用等)，而在生物大分子的分離純化中有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，市場上已經(jīng)有商品化的磁性微球，但價(jià)格昂貴。因此，如何開發(fā)出粒度比較均勻、懸浮穩(wěn)定性好、磁響應(yīng)性強(qiáng)和表面富含多種活性功能基團(tuán)的磁性微球是今后該領(lǐng)域的一個(gè)研究重點(diǎn)，而如何提高磁性微球?qū)ι锎蠓肿拥挠H和能力和專一性也是致力于生化分離技術(shù)研究工作者的努力方向。作為一種新型的功能化材料，相信不久的將來，生物磁性微球分離技術(shù)必將得到進(jìn)一步更深入的發(fā)展，從而促進(jìn)整個(gè)生化分離技術(shù)得到進(jìn)步。

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【責(zé)任編輯 趙建萍】

Preparation of Magnetic Microspheres and the Review of Their Application in Separation and Purification of Biological Macromolecules

WANG Yan, WANG Ya-tao

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu)

Magnetic microspheres are a new functional material because its unique advantages are widely used in the field of environmental engineering, biomedical engineering, biochemical isolation and cell biology. However, the present research status and the development trend of magnetic microspheres indicate that how to develop magnetic microspheres with uniform particle size, good suspension stability, and strong magnetic response and variety active functional groups is one of the future research focuses.

magnetic microspheres; separation; purification; biomacromolecule

1674-1730(2017)01-0038-05

2016-03-24

王 妍(1988—)，女，甘肅正寧人，助教，碩士，主要從事液相色譜填料的合成及其應(yīng)用研究

TB383

A