杜智慧，沈 文，劉海燕，王繼雪，楊 義,孫延鳴

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

巴什拜羊與其雜交羊?qū)d羊肺炎支原體感染的比較

杜智慧，沈 文，劉海燕，王繼雪，楊 義,孫延鳴*

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

為了比較巴什拜羊與其雜交羊?qū)d羊肺炎支原體(MO)感染的差異，將6只巴什拜羊和6只雜交羊人工感染MO，分別觀察其臨床癥狀和病理解剖變化，用ELISA方法分別檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度，制作肺部組織切片觀察組織病理學(xué)變化，并進(jìn)行組織病理學(xué)評分。結(jié)果顯示，感染后雜交羊比巴什拜羊表現(xiàn)出更嚴(yán)重的、典型的支原體肺炎的臨床癥狀和病理剖檢變化。組織病理學(xué)評分結(jié)果顯示，雜交羊的評分顯著高于巴什拜羊。相關(guān)細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，雜交羊血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度均顯著高于巴什拜羊。結(jié)果表明，巴氏拜羊?qū)O感染具有一定的抗性，而雜交羊?qū)O較易感。

巴什拜羊；盤羊雜交羊；綿羊肺炎支原體；人工感染

羊支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats)又稱羊傳染性胸膜肺炎，是由支原體感染引起的一種高度接觸性傳染病，其臨床特征為高熱，咳嗽，胸和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥，取急性和慢性經(jīng)過，病死率較高。綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)主要危害幼齡羔羊，是引起綿羊和山羊特別是羔羊增生性間質(zhì)性肺炎的主要病原體，羊感染后以咳嗽、喘氣、流鼻汁、貧血、生長發(fā)育遲緩、消瘦及間質(zhì)性肺炎等為臨床癥狀[1]。目前，我國大部分地區(qū)均有綿羊支原體肺炎的發(fā)生與流行，該病發(fā)病率高，死亡率逐漸上升。

巴什拜羊是新疆優(yōu)秀的地方品種資源，原產(chǎn)中國新疆裕民縣。該羊毛色以紅棕色為主，體形呈方圓形，角呈棱形，頸中等長，背平直，具有生長發(fā)育速度快、產(chǎn)肉性能高、抗病力強(qiáng)等特征[2]。

盤羊(Ovisammon)又稱為大角羊、大頭羊、大頭彎羊、亞洲巨野羊等，是體形最大的野生羊類，為國家二級保護(hù)野生動(dòng)物。盤羊與巴什拜羊雜交為種間雜交，其雜交后代羔羊在早期生長發(fā)育速度很快[3]。但在以后的飼養(yǎng)管理中發(fā)現(xiàn)雜交羊大量死亡，通過對發(fā)病雜交羊的流行病學(xué)調(diào)查與MO ELISA抗體檢測試劑盒診斷發(fā)現(xiàn)，75.5%的死亡雜交羊?yàn)镸O感染，而在相同條件下飼養(yǎng)的巴什拜羔羊則未發(fā)現(xiàn)有發(fā)病與死亡情況。說明巴什拜羊和雜交羊?qū)O的感染易感性可能有所差異。

本試驗(yàn)通過對巴什拜羔羊和雜交羔羊人工感染MO，分別觀察其臨床癥狀，檢測血清中相關(guān)細(xì)胞因子水平，觀察病理剖檢變化和組織病理學(xué)變化，從而比較巴什拜羊與其雜交羊?qū)O感染的差異，為進(jìn)一步深入研究綿羊的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和試驗(yàn)用動(dòng)物 綿羊肺炎支原體菌株由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室剡根強(qiáng)教授贈(zèng)予，與Y-98標(biāo)準(zhǔn)株的同源性為98%。6只巴什拜羊購自塔城裕民縣羊場，6只雜交羊(盤羊♂×巴什拜羊♀)購自第九師170團(tuán)種羊場，均為2月齡～3月齡，體重為10 kg～15 kg，MO ELISA抗體檢測均為陰性。

1.1.2 主要試劑 MO專用培養(yǎng)基，蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰研究員贈(zèng)予；MO ELISA 診斷試劑盒及綿羊IL-1β、IL-6、IL-9、IFN-γ ELISA試劑盒，美國RD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)羊分組與感染 體外培養(yǎng)MO及人工感染按參考文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行，采用氣管內(nèi)注射感染所有試驗(yàn)羊。感染時(shí)所使用的MO濃度約為 CCU=106/mL，2 mL/只，試驗(yàn)過程中飼料中均不添加抗生素。將6只巴什拜羊設(shè)為A組，6只雜交羊設(shè)為B組。

1.2.2 臨床觀察與MO抗體檢測 每天清晨定時(shí)測量體溫，并觀察臨床癥狀，直至試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)結(jié)束后宰殺試驗(yàn)羊，檢查肺臟病變。在感染前和感染2周后，采血分離血清，使用MO ELISA診斷試劑盒檢測抗體水平，按試劑盒說明書操作。

1.2.3 人工感染前后血清細(xì)胞因子的ELISA檢測 在感染前(第0 d)及感染后第2、5、7、14、21天頸靜脈采集所有羊的靜脈血，室溫傾斜放置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清，置-20℃保存?zhèn)溆谩⒄誆LISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度。

1.2.4 病變組織觀察及組織病理學(xué)評分 兩組羊宰殺之后，觀察肺組織病變，記錄、照相。取每只羊的左右肺組織用100 mL/L福爾馬林固定，進(jìn)行梯度乙醇脫水、組織透明處理、浸蠟、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化，參照張慧[5]對急性支原體肺炎動(dòng)物模型的組織病理學(xué)評分系統(tǒng)，以0～26分的組織病理學(xué)評分來確定肺部的炎癥反應(yīng)程度，評分包括支氣管/細(xì)支氣管周圍浸潤部位的百分比、支氣管/細(xì)支氣管管腔炎性細(xì)胞浸潤的多少、支氣管/細(xì)支氣管管腔炎性滲出的嚴(yán)重程度、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤的百分比、實(shí)質(zhì)性肺炎嚴(yán)重程度五方面。每一側(cè)肺的評分相加之后除以2而構(gòu)成每只動(dòng)物的評分。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察與MO抗體檢測結(jié)果

A組巴什拜羊在感染后2 d ～3 d表現(xiàn)為食欲減退、體溫一過性升高(40℃～41℃)、咳嗽，呼吸啰音,之后體溫基本恢復(fù)正常，無死亡病例。B組雜交羊感染后表現(xiàn)為嚴(yán)重咳嗽、流漿液性鼻涕，體溫升高(40℃～42℃)并持續(xù)不下，食欲減退，頭頸伸直，腰背拱起，個(gè)別羊出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉和呼吸啰音，在感染后第23天和第25天各死亡1只(共死亡2只)，死亡率為33%。用MO ELISA抗體檢測試劑盒檢測所有試驗(yàn)羊血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染前兩組羊均為陰性，感染2周后均為陽性，說明人工感染成功。

2.2 肺病變組織觀察與組織病理學(xué)評分結(jié)果

在人工感染后第26天，屠宰兩組試驗(yàn)羊，剖檢后發(fā)現(xiàn)A組巴什拜羊的肺表面有輕微出血點(diǎn)(圖1)，個(gè)別羊胸腔有少量淡黃色液體；B組雜交羊的肺表面有黑紅色至灰色不等的肝變區(qū)，稍凸出于肺表面，有出血點(diǎn)、出血斑及表面凸出結(jié)節(jié)(圖2)，切面呈大理石樣，胸膜有黃白色纖維素層附著，胸膜與肋膜發(fā)生黏連，胸腔有大量淡黃色液體。

圖1 感染巴什拜羊肺部表面有輕微出血點(diǎn)

圖2 雜交羊肺部嚴(yán)重肉變、肝變、出血點(diǎn)和出血斑

肺臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果，A組巴什拜羊表現(xiàn)為輕度病變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，局部視野肺間質(zhì)增寬，其間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淡粉色滲出液浸潤。細(xì)支氣管上皮細(xì)胞排列尚規(guī)則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3)。B組雜交羊肺臟均表現(xiàn)重度病變，其病變范圍廣泛，大部分視野可見肺間質(zhì)明顯變寬，壓迫肺間質(zhì)致使連成片，肺泡腔消失，間隔內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮破壞，脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)血管、支氣管旁小靜脈淤血突出(圖4)。對兩個(gè)組綿羊肺部組織病理學(xué)評分，結(jié)果A組平均分為9.4，B組平均分19.9，B組評分顯著高于A組的(P<0.05)。

2.3 IL-1β檢測結(jié)果

人工感染MO前后兩組羊血清中IL-1β水平檢測結(jié)果如表1所示，感染后巴什拜羊和雜交羊血清中的IL-1β含量均高于感染前的，雜交羊血清中IL-1β含量相應(yīng)高于巴什拜羊的。第21天，巴什拜羊血清中IL-1β含量降低，且顯著低于雜交羊的(P<0.05)。

A.10×;B.40×

A.10×;B.40×

2.4 IL-6檢測結(jié)果

如表2所示。感染后第2天至第5天，巴氏拜羊血清中IL-6的濃度顯著低于雜交羊的(P<0.05)，感染后第7天至第21天，巴氏拜羊極顯著低于雜交羊(P<0.01)。雜交羊在感染后血清IL-6水平逐漸升高，而巴氏拜羊在感染后第5天血清IL-6水平有逐漸降低的趨勢，說明雜交羊體內(nèi)的炎癥程度明顯高于巴氏拜羊。

表1 MO感染前后兩組羊血清IL-1β水平檢測結(jié)果

注：同一行中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same line，different small letters indicate significant difference(P<0.05).

表2 MO感染前后兩組羊血清中IL-6水平檢測結(jié)果

注：同一行中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:In the same line，different small letters indicate significant difference(P<0.05); different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).

2.5 IL-9檢測結(jié)果

如表3所示，感染后兩組羊血清中IL-9水平均升高，第7天，兩組羊血清中IL-9水平分別達(dá)到最高，其中巴什拜羊血清中IL-9含量極顯著低于雜交羊(P<0.01)。第14天至第21天兩組羊血清中IL-9含量開始下降，第14天和第21天巴什拜羊血清中IL-9含量極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)低于雜交羊。

2.6 IFN-γ檢測結(jié)果

如表4所示，感染MO后，兩組羊血清中IFN-γ含量逐漸升高，且均高于感染前的水平。感染后第14天至第21天，巴什拜羊血清中IFN-γ含量開始下降，而雜交羊的則繼續(xù)升高，并且雜交羊的顯著和極顯著高于巴什拜羊(P<0.05；P<0.01)。

表3 MO感染前后兩組羊IL-9的血清濃度

注：同一行中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:In the same line，different small letters indicate significant difference(P<0.05); different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).

表4 MO感染前后兩組羊IFN-γ的血清濃度

注：同一行中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:In the same line，different small letters indicate significant difference(P<0.05); different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).

3 討論

本試驗(yàn)選擇巴什拜羊及其雜交羊?yàn)檠芯繉ο?，人工感染MO建立疾病模型，采用觀察臨床癥狀，剖檢病理變化，肺部組織學(xué)病理變化，外周血中相關(guān)細(xì)胞因子變化檢測，比較深入地比較了巴什拜羊及其雜交羊?qū)O感染的差異。

人工感染試驗(yàn)中，均能從兩組羊血清中檢測到MO抗體，說明MO人工感染成功。據(jù)海拉提·庫爾曼報(bào)道[6]，巴什拜羊與盤羊的雜交后代適應(yīng)性差，雜交羊因呼吸道和其他疾病的死亡率與巴什拜羊的相比差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)中，A組巴什拜羊出現(xiàn)體溫一過性升高、咳嗽和流鼻液等較輕癥狀，剖檢癥狀不典型。B組雜交羊有體溫升高且持續(xù)較久，咳嗽、流漿液性鼻涕、嚴(yán)重呼吸啰音及腹瀉癥狀，剖檢肺部出現(xiàn)明顯的肝變和肉變以及大量出血點(diǎn)，死亡率33.3%。這一結(jié)果與海拉提·庫爾曼的結(jié)果相似。

研究表明，肺炎支原體感染后，是通過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，激活內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞，繼而調(diào)節(jié)黏附因子的合成及其在細(xì)胞表面的表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，并認(rèn)為這些細(xì)胞因子可能是肺炎支原體致病機(jī)制之一[7]。

IL-1β是一種生物學(xué)功能非常復(fù)雜的多肽類細(xì)胞因子，是參與免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑。 Yang J等[8-9]在研究肺炎支原體感染過程中發(fā)現(xiàn)人外周血單核細(xì)胞、人肺上皮腫瘤細(xì)胞A549、人髓單核系細(xì)胞等都表達(dá)高水平的IL-1β。在Balb/c小鼠支原體肺炎模型中，小鼠在感染初期和后期IL-1β mRNA表達(dá)水平增加[10]。本試驗(yàn)中，雜交羊血清中IL-1β濃度均高于巴什拜羊的，說明雜交羊感染MO更嚴(yán)重。

有研究表明[11]，IL-6的血清濃度與患者炎癥反應(yīng)程度及感染的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為判斷病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。本試驗(yàn)中，雜交羊血清中IL-6濃度顯著或極顯著地高于巴什拜羊的，說明雜交羊的炎癥程度顯著高于巴氏拜羊的。

IL-9是TH9細(xì)胞的效應(yīng)分子，介導(dǎo)JAK/STAT信號通路，是參與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子[12]。在患有支原體肺炎的兒童中發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎患兒外周血Th9細(xì)胞百分率及其IL-9水平均高于健康對照組的，推測Th9細(xì)胞及IL-9的異常高表達(dá)可能參與了兒童肺炎支原體感染的過程，并可作為肺炎支原體感染患兒病情發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的評價(jià)指標(biāo)[13-14]。邵莉等[15]利用小鼠支原體肺炎模型研究發(fā)現(xiàn)，支原體哮喘組IL-9水平顯著高于哮喘組和對照組的，提示支原體感染可能導(dǎo)致Th1/Th9的偏移，IL-9參與了炎癥的發(fā)展。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，感染MO后，兩組羊血清中IL-9濃度均開始升高，感染第7天至21天，雜交羊血清中IL-9濃度始終明顯高于巴什拜羊的，這可能是雜交羊易感MO，故表現(xiàn)出典型支原體肺炎癥狀的原因之一，巴什拜羊在感染后第14天至第21天血清IL-9濃度開始下降，這也可能是巴什拜羊感染MO后癥狀輕微，表現(xiàn)出抗性的原因。

IFN-γ為Th1型促炎細(xì)胞因子，能抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用。有研究表明，肺炎支原體感染的小鼠模型及支原體肺炎病人中都可以檢測到IFN-γ水平升高[16-17]，本試驗(yàn)的結(jié)果也與其相一致。在感染初期，兩組羊的IFN-γ濃度都隨時(shí)間延長而升高，雜交羊的在整個(gè)21 d的試驗(yàn)期內(nèi)都是升高的，而巴什拜羊在感染后第7天就逐漸降低，趨于感染前水平，這與高偉[18]觀察到感染支原體肺炎的大鼠在感染初期IFN-γ升高在恢復(fù)期降低的是一致的，說明巴什拜羊感染MO后，在短時(shí)間內(nèi)可逐漸恢復(fù)，而雜交羊則不能自行恢復(fù)。

通過人工感染MO，巴什拜羊和其雜交羊在臨床癥狀，剖檢病理變化，肺部組織學(xué)病理變化，以及相關(guān)細(xì)胞因子相比有明顯差異，說明巴什拜羊?qū)O感染具有一定的抗性，而雜交羊?qū)O較易感，對造成此結(jié)果具體原因，有待進(jìn)一步深入研究。

[1] 鮑興智,嚴(yán) 軍.綿羊肺炎支原體的研究進(jìn)展[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2009,39(6):45-46.

[2] 決肯·阿尼瓦爾,韓業(yè)東,李齊發(fā),等.巴什拜羊微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性及其與生長指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(16):3425-3432.

[3] 馬長賓，孫延鳴,朱曉光,等.新疆野生盤羊與巴什拜羊雜交一代生產(chǎn)性能測定[J].畜禽業(yè)，2009(2)：44-45

[4] 姜方配，沈 文，魯海富,等.ISG15 蛋白對感染綿羊肺炎支原體的盤羊雜交羊的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(11):925-928.

[5] 張 慧,趙宗勝,趙 鳳,等.綿羊支原體肺炎中不同甘露 (聚) 糖結(jié)合凝集素基因型對肺組織病變的影響[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,34(4):293-296.

[6] 海拉提·庫爾曼,依明·蘇來曼,杜 曼,等.巴什拜羊與野生盤羊后代雜種的適應(yīng)性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(2):129-131.

[7] 郭海英,王明哲,陳冬梅,等.綿羊肺炎支原體感染羊細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化[J].畜牧與獸醫(yī),2015,47(8):1-4.

[8] Yang J,Hooper W C,Phillips D J,et al.Regulation of proinflammatory cytokines in human lung epithelial cells infected withMycoplasmapneumoniae[J].Infect Immun，2002,70:3649-3655.

[9] Yang J,Hooper W C,Phillips D J,et al.Interleukin-1beta responses toMycoplasmapneumoniaeinfection are cell-type specific[J].Microb Pathog，2003,34:17-25.

[10] Pietsch K,Ehlers S,Jacobs E. Cytokine gene expression in the lungs of BALB/c mice during primary and secondary intranasal infection withMycoplasmapneumoniae[J].Microbiology,1994,140(8):2043-2048.

[11] Reinhart K,Menges T,Cardlund B,et al.Randomized,placebo-controlled trial of the antitumor necrosis factor antibody fragment a felmiomab in hyper inflammatory response during severe sepsis:The RAM SES Study [ J].Crit Care Med,2001,(29):765- 769.

[12] Veldhoen M, Uyttenhove C, van Snick J,et al.Transforming growth factor-beta 'reprograms' the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset[J].Nat Immunol,2008,9(12):1341-1346.

[13] Shao L,Cong Z,Li X ,et al.Changes in levels of IL-9,IL-17,IFN-γ,dendritic cell numbers and TLR expression in peripheral blood in asthmatic children withMycoplasmapneumoniaeinfection[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,8(5):5263-5272.

[14] 王建勇,鄭 靜,邢海燕,等.Th9細(xì)胞與IL-9在肺炎支原體感染患兒中的檢測及其臨床意義[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2015(4):308-311.

[15] 邵 莉,曹蘭芳,李曉麗,等.支氣管哮喘合并肺炎支原體感染小鼠模型白介素9、白介素17、γ 干擾素的變化[J].內(nèi)科理論與實(shí)踐,2016,11(1):47-51.

[16] Tanaka H,Narita M,Teramoto S,et al.Role of interleukin-18 and T-helper type 1 cytokines in the development ofMycoplasmapneumoniaepneumonia in adults[J].Chest，2002,121:1493-1497.

[17] Yang J,Hooper W C,Phillips D J,et al.Cytokines inMycoplasmapneumoniaeinfections[J].Cytokine & Growth Factor Reviews,2004,15(2):157-168.

[18] 高 偉.肺炎支原體感染的臨床治療分析及免疫學(xué)致病機(jī)制研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2011.

Comparison ofMycoplasmaovipneumoniaeInfection between Bashbay Sheep and Its Crossbred Sheep

DU Zhi-hui ,SHEN Wen,LIU Hai-yan,WANG Ji-xue,YANG Yi,SUN Yan-ming

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832003,China)

In order to compare the difference ofMycoplasmaovipneumoniae(MO) infection between Bashbay sheep and its crossbred sheep，6 Bashbay sheep and 6 hybrid sheep were infected with MO,and their clinical symptoms and pathological lesions were observed.IL-1β,IL-6,IL-9 and IFN-γ concentrations in sera were measured by ELISA.Histopathological lesions of lung tissues were observed by pathological sections and histopathological scores were obtained.The results showed that the post-infection hybrid sheep represented more severe,typical mycoplasma pneumonia clinical symptoms and pathological lesions than Bashbay sheep.The results of histopathological scoring found that the hybrid sheep was significantly higher than Bashbay sheep.The results of cytokine test showed that the concentrations of IL-1β,IL-6,IL-9 and IFN-γ in sera of hybrid sheep were significantly higher than those of Bashbay sheep.Bashbay sheep has certain resistance to MO infection,while hybrid sheep was more susceptible to MO.

Bashbay sheep；argali hybrid sheep；Mycoplasmaovipneumoniae；artificial infection

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31460686)

杜智慧(1991-)，女，湖南邵東人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.62

A

1007-5038(2017)01-0069-05