李敏超 束婷婷 唐偉 婁青林 顧劉寶

Salubrinal通過抗氧化應(yīng)激延緩細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究

李敏超 束婷婷 唐偉 婁青林 顧劉寶

目的 觀察Salubrinal對(duì)Etoposide誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)衰老的保護(hù)作用,并探討其可能的作用機(jī)制。 方法 將NRK-52E細(xì)胞株分為對(duì)照組、衰老組(Etoposide 1μg/ml誘導(dǎo))及治療組(Etoposide 1μg/ml+Salubrinal 50 μmol/L),藥物干預(yù)24 h后于倒置顯微鏡下觀察各組NRK-52E細(xì)胞形態(tài),β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色方法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況,熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)p16啟動(dòng)子活性,DCFH法檢測(cè)ROS的水平, Western blot法檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志性蛋白c-fos表達(dá)水平。 結(jié)果 與對(duì)照組相比,Etoposide刺激24 h后NRK-52E細(xì)胞衰老明顯增加,Salubrinal干預(yù)后NRK-52E細(xì)胞衰老形態(tài)改善;Etoposide刺激后活性氧(ROS)產(chǎn)生增多,p16啟動(dòng)子活性增強(qiáng),c-fos表達(dá)增加,Salubrinal干預(yù)后上述現(xiàn)象均被逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論 Salubrinal可能通過抗氧化應(yīng)激延緩Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞衰老。

Salubrinal;衰老;氧化應(yīng)激;保護(hù)

細(xì)胞衰老最初由Hayflick 在1961 年觀察到,指細(xì)胞由生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴纳L(zhǎng)停止?fàn)顟B(tài)[1]。細(xì)胞衰老是個(gè)體衰老在細(xì)胞水平的體現(xiàn),常被用作衰老研究的實(shí)驗(yàn)工具[2]。細(xì)胞衰老與個(gè)體衰老關(guān)系密切, 組織器官中衰老細(xì)胞的比例隨年齡上升而逐漸上升[3],細(xì)胞衰老可以通過多種途徑促進(jìn)個(gè)體衰老及衰老相關(guān)性疾病[4],而清除衰老細(xì)胞能有效延緩衰老癥狀的出現(xiàn)[5]。因此,延緩細(xì)胞衰老對(duì)于整體抗衰老具有極為重要的意義和作用。

Salubrinal是一種小分子化合物,由Boyce等[6]在2005年首先報(bào)道。研究顯示,Salubrinal對(duì)細(xì)胞具有多方面的保護(hù)作用,可以對(duì)抗多種病理狀態(tài)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[7],能改善氧化應(yīng)激[8],抑制 NF-κB 活性[9]。氧化應(yīng)激是細(xì)胞衰老的促進(jìn)因素,干細(xì)胞的DNA損傷常伴氧化應(yīng)激,是干細(xì)胞衰老的問責(zé)因子[10]。同時(shí)氧化應(yīng)激是衰老的主要驅(qū)動(dòng)力之一,在衰老和衰老相關(guān)性疾病中可以發(fā)現(xiàn)過多的活性氧及其他氧化應(yīng)激產(chǎn)物[11]。因此,本研究建立Etoposide誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞衰老模型,予Salubrinal進(jìn)行干預(yù),探討Salubrinal通過抗氧化應(yīng)激延緩細(xì)胞衰老的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 Etoposide購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社,刺激濃度為1 μg/ml;Salubrinal 購(gòu)自埃利斯維爾tocris生物科學(xué),刺激濃度為50 μmol/L。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、0.25%胰酶均購(gòu)自于Gibco公司?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天有限公司。p16INK4a-luc質(zhì)粒由日本昭和大學(xué)Kiyoshi Nose教授惠贈(zèng)。c-fos、β-actin和羊抗兔IgG等抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。ECL(Electro-Chemi-Luminescence)發(fā)光液和PVDF(Polyvinylidene fluoride)膜購(gòu)于Millipore公司。

1.2 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);低速離心機(jī)(美國(guó)Scilogex公司);PowerPacBasic電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);熒光素酶分析系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)。

1.3 大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)培養(yǎng)及干預(yù) NRK-52E細(xì)胞株由日本山梨大學(xué)Kitamura教授惠贈(zèng)。NRK-52E細(xì)胞用5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí),棄原培養(yǎng)基,均勻加入0.25%胰酶1 ml,置于培養(yǎng)箱中消化約3 min,待貼壁細(xì)胞漂浮后,用5 ml培養(yǎng)基終止消化,吹打混勻制成單細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,于低速離心機(jī)中1000 r/min離心4 min。吸去上清液,向細(xì)胞團(tuán)塊中加入適量培養(yǎng)基,1/4～1/3傳代,每2～3 d傳代1次。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔的密度鋪板至6孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,衰老組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激,治療組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激及濃度為50 μmol/L 的Salubrinal干預(yù),干預(yù)后24 h觀察細(xì)胞形態(tài)及p16INK4a啟動(dòng)子活性變化。

1.4 倒置顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞接種于6孔板,鋪板密度為2×105個(gè)/孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,分組給藥刺激,24 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)變化,并以倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司CK40-SL)拍攝細(xì)胞形態(tài)照片(200倍)。

1.5 SA-β-gal染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收板以3% 福爾馬林固定細(xì)胞4 min,于X-gal溶液在37 ℃下培育6～24 h,倒置顯微鏡可見衰老細(xì)胞可經(jīng)此法陽(yáng)染而成為藍(lán)色。X-gal溶液組成:1 mg/ml X-gal,40 mmol/L pH 6.0的citric acid/sodium phosphate,5 mmol/L potassium ferricyanide, 5 mmol/L potassium ferrocyanide, 150 mmol/L氯化鈉和2 mmol/L氯化鎂。

1.6 ROS檢測(cè) 將NRK-52E細(xì)胞以1×105/孔的密度鋪板于12孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,給細(xì)胞換液,按6 h,1 h時(shí)間點(diǎn)給予藥物刺激,置于培養(yǎng)箱30 min后,用不含血清的培養(yǎng)液洗3遍,裝載探針,25 min后,再用不含血清的培養(yǎng)液洗3遍,置于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶檢測(cè) 將NRK-52E細(xì)胞鋪于35 mm培養(yǎng)皿中,細(xì)胞數(shù)約2×105個(gè),當(dāng)生長(zhǎng)融合接近80%時(shí),將6 μl lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑及3 μg pGL2-p16INK4a-luc質(zhì)粒分別加入500 μl不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中,吹打混勻后靜置5 min,然后將加入質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑的液體混勻后靜置20 min,最后將上述混合液均勻滴入細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,置于培養(yǎng)箱中6～8 h后換液,即得到轉(zhuǎn)染pGL2-p16INK4a質(zhì)粒的細(xì)胞,于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后重新鋪板于96孔板,密度為2×104/孔,24 h后給予藥物刺激,衰老組予濃度為1 μg/mL的Etoposide刺激,治療組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激及濃度為50 μmol/L的Salubrinal干預(yù)24 h后收板并檢測(cè)各組luciferase值,熒光素酶的活性通過熒光素酶分析系統(tǒng)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行評(píng)估,以CCK-8(Cell Counting Kit)結(jié)果校正細(xì)胞數(shù)量。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 吸去待收板細(xì)胞原培養(yǎng)液,PBS緩沖液洗2遍后加入裂解液,于冰上充分震蕩裂解,BSA(Bovine Serum Albumin)法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品各60 μg,在電泳槽中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,TBST(TBS+Tween)封閉1 h,一抗孵育過夜,其中c-fos抗體滴度1∶1000,β-actin 抗體滴度1∶2000。TBST洗膜5 min×3次,二抗孵育1.5 h,TBST再次洗膜5 min×3次,化學(xué)發(fā)光法成像。蛋白含量用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Salubrinal改善Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞衰老形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)特殊變化;Etoposide刺激NRK-52E細(xì)胞24 h后,形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞體積變大,細(xì)胞扁平,胞核體積增加,多核,衰老形態(tài)細(xì)胞增加;Salubrinal干預(yù)后細(xì)胞衰老的形態(tài)改善,胞核體積減小,多核減少,衰老形態(tài)的細(xì)胞減少。見圖1。

2.2 SA-β-gal染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察,衰老形態(tài)的細(xì)胞SA-β-gal染色呈藍(lán)色。對(duì)照組著染陰性,Etoposide處理細(xì)胞24 h后SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加,Salubrinal干預(yù)組SA-β-gal染色減弱,計(jì)算2組染色陽(yáng)性率細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 Salubrinal改善Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞衰老形態(tài)學(xué)改變(×200)

2.3 Salubrinal抑制Etoposide誘導(dǎo)的p16INK4a轉(zhuǎn)錄激活 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p16INK4a質(zhì)粒24 h后,用Etoposide及Salubrinal處理細(xì)胞,24 h后進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)以評(píng)價(jià)p16INK4a啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示,Etoposide可誘導(dǎo)p16INK4a啟動(dòng)子活性增強(qiáng),Salubrinal干預(yù)后可部分逆轉(zhuǎn)p16INK4a啟動(dòng)子活性的升高。見圖3。

圖3 Salubrinal抑制Etoposide誘導(dǎo)的p16INK4a活性

2.4 Salubrinal抑制Etoposide刺激后NRK-52E細(xì)胞ROS的產(chǎn)生 對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞在裝載探針DCFH后僅能觀察到細(xì)胞本底水平的熒光;Etoposide刺激1 h,6 h后細(xì)胞熒光顯著增強(qiáng),呈時(shí)間梯度增加;Salubrinal干預(yù)后熒光減弱,表明Salubrinal可以逆轉(zhuǎn)Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞ROS的升高。見圖4。

圖4 Salubrinal抑制Etoposide刺激后NRK-52E細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

2.5 Salubrinal抑制Etoposide誘導(dǎo)的c-fos蛋白表達(dá)升高 與對(duì)照組相比,Etoposide處理后氧化應(yīng)激蛋白c-fos表達(dá)蛋白明顯增加;Salubrinal干預(yù)后c-fos蛋白下調(diào)(1 h)。提示Salubrinal可抑制Etoposide誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志性蛋白c-fos表達(dá)水平的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Salubrinal可以抑制Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞衰老,緩解Etoposide對(duì)細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激,從而發(fā)揮對(duì)抗衰老的作用。目前對(duì)Salubrinal的生物學(xué)功能研究主要集中在其對(duì)抗細(xì)胞凋亡的研究,對(duì)其在改善細(xì)胞衰老方面的研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)采用Etoposide誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,該方法是經(jīng)典的衰老模型,倒置顯微鏡及SA-β-gal染色均可證實(shí)細(xì)胞衰老的發(fā)生。Salubrinal可明顯改善Etoposide誘導(dǎo)細(xì)胞衰老形態(tài)。除形態(tài)學(xué)的改善,Salubrinal還可抑制Etoposide誘導(dǎo)的pGL2-p16INK4a轉(zhuǎn)錄激活。Salubrinal同時(shí)改善Etoposide誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激,包括逆轉(zhuǎn)Etoposide誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞ROS的升高,抑制Etoposide誘導(dǎo)的c-fos蛋白表達(dá)升高。

研究表明,細(xì)胞衰老與氧化應(yīng)激存在密切聯(lián)系,氧化應(yīng)激通過損傷DNA使維持細(xì)胞基本生理功能的基因表達(dá)失活,從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[12],進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。一方面,隨著年齡的增長(zhǎng),線粒體內(nèi)的ROS 會(huì)不斷累積增加。過多的ROS會(huì)導(dǎo)致生物膜損傷、蛋白質(zhì)損傷和mtDNA 氧化損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老。另一方面,機(jī)體氧化與抗氧化水平失衡也是導(dǎo)致衰老的重要因素[13]。ROS和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物可以同時(shí)作用于基因組和線粒體DNA,導(dǎo)致各類DNA損傷:雙和單鏈斷裂,DNA加合物形成,DNA堿基和脫氧核糖改變。DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)是最危險(xiǎn)的損害。他們?cè)斐蓢?yán)重的基因突變,導(dǎo)致各種疾病和腫瘤進(jìn)展[14]。如果細(xì)胞修復(fù)及時(shí)的話，單鏈斷裂(single-strand breaks,SSBs)對(duì)細(xì)胞的有害性不大。如果修復(fù)不快,染色體的單鍵斷裂也會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p害并導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生[15]。

當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),體內(nèi)組織細(xì)胞ROS 增加, 當(dāng)超過機(jī)體清除能力時(shí)就會(huì)導(dǎo)致 ROS 蓄積。研究證實(shí),ROS 能有效地激活 c-fos[16],因此,c-fos是反映氧化應(yīng)激水平的重要因素。

綜上所述,Salubrinal可緩解Etoposide對(duì)ROS、c-fos等氧化應(yīng)激分子的激活,因此其對(duì)抗衰老的可能作用機(jī)制之一為改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Salubrinal發(fā)揮上述作用的更深層次機(jī)制包括端粒酶,其他衰老相關(guān)蛋白如cyclin A、 cyclin B1等的研究,尚未深入進(jìn)行,后續(xù)工作有待進(jìn)一步展開。

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Intervention of cellular senescence by Salubrinal through inhibition of oxidative stress

LIMin-chao,TANGWei,LOUQing-lin,GULiu-bao.

DiabetesCenter;

SHUTing-ting.

CentralLaboratory,JiangsuGeriatricHospital,Nanjing210024;

LIMin-chao.

NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China

Objective To investigate the protective effects of Salubrinal on Etoposide-induced cellular senescence in tubular epithelial cells (NRK-52E), and to explore the possible mechanisms. Methods NRK-52E cells were divided into control group (control), senescence group (Etoposide 1 μg/ml) and salubrinal-treated group (Etoposide 1 μg/mL+Salubrinal 50 μM). After 24 h of intervention, cells were observed under an inverted microscope for cellular morphology and β-galactosidase activity (SA-β-gal) staining to detect cell senescence. The cellular senescence was further confirmed by a luciferase reporter system reflecting p16 promoter activity. The levels of ROS were tested using a ROS-DCFH assay. In addition, the expressions of c-fos and the marker of oxidative stress were tested by western blot. Results Treatment with Etoposide for 24 h obviously induced cellular senescence in NRK-52E cells, including morphological changes, positive SA-β-gal staining, and increased p16 promoter activity. The intervention of Salubrinal markedly attenuated NRK-52E cell senescence. Etoposide induced the production of ROS and expression of c-fos, which were suppressed by the treatment with Salubrinal. Conclusions Salubrinal may attenuate Etoposide-induced NRK-52E cellular senescence by inhibiting oxidative stress.

Salubrinal; senescence; oxidative stress; protection

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81300257)

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院糖尿病防治研究中心(李敏超,唐偉,婁青林,顧劉寶)；中心實(shí)驗(yàn)室(束婷婷)；210029江蘇省南京市，南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(李敏超)

顧劉寶，Email：abobgu@sina.com

R 592

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.008

2016-06-19)