王 峭，馬金娟，楊立軍，李 強，王保通

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.湖北省農(nóng)科院植保土肥研究所，湖北武漢 430064)

2015年湖北省小麥條銹菌群體結(jié)構(gòu)及多樣性分析

王 峭1，馬金娟1，楊立軍2，李 強1，王保通1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.湖北省農(nóng)科院植保土肥研究所，湖北武漢 430064)

為了明確湖北省小麥條銹菌生理小種的構(gòu)成以及變化動態(tài)，利用中國鑒別寄主對2015年采自湖北省6個地(市)的102份條銹病標(biāo)樣進行了群體結(jié)構(gòu)分析，鑒定到已知條銹菌小種(類型)19個，其中CYR33和CYR32是湖北省的優(yōu)勢小種，出現(xiàn)頻率分別居第一位(40.2%)和第二位(17.65%)，其他小種(類型)以水源11類群、Hybrid 46類群以及貴農(nóng)22類群為主，首次從湖北省標(biāo)樣中監(jiān)測到貴農(nóng)22菌系，其出現(xiàn)頻率為17.64%。群體多樣性研究結(jié)果表明，被測條銹病標(biāo)樣在物種水平上的Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為 0.19，Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.31,表明湖北省小麥條銹菌毒性多樣性比較豐富。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，湖北省小麥條銹菌群體毒性遺傳相似系數(shù)范圍為0.95～0.99，相似系數(shù)較高，遺傳距離較小，群體之間交流廣泛，并且毒性遺傳結(jié)構(gòu)與地理距離無相關(guān)性。

湖北??；小麥條銹菌；生理小種；群體結(jié)構(gòu)；毒性多樣性

小麥條銹病是由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的一種氣流傳播性病害，在全球大多數(shù)小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，具有分布范圍廣、流行頻率高、暴發(fā)性強、為害嚴(yán)重等特點[1],是我國小麥危害最嚴(yán)重的病害之一和主要監(jiān)控防治對象[2-3]。選育和種植抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟、有效和對環(huán)境安全的措施。但由于小麥條銹菌生理小種具有高度變異性，新小種的產(chǎn)生并發(fā)展成為優(yōu)勢小種是品種抗銹性喪失的主要因素[4-5]。湖北省是我國小麥條銹病流行體系中重要的冬繁區(qū)，也是小麥條銹病菌由西北向黃淮海廣大麥區(qū)傳播的重要“橋梁”地區(qū)和“咽喉”地帶[6]，為包括豫南、華北小麥主產(chǎn)區(qū)提供春季菌源[7]。因此，明確湖北省小麥條銹菌生理小種的構(gòu)成以及動態(tài)變化對指導(dǎo)我國黃淮海小麥主產(chǎn)區(qū)小麥品種布局和全國條銹病的防控具有重要意義。本研究利用我國小麥條銹菌鑒別寄主對采自湖北省6個地(市)的102份條銹病標(biāo)樣進行了鑒定和群體結(jié)構(gòu)分析，以期為湖北小麥的抗病育種和抗病品種合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 小麥條銹菌標(biāo)樣

2015年4月份在湖北省荊州、宜城、荊門、襄陽、枝江、十堰等6個地(市)的7個縣(區(qū))采集小麥條銹菌標(biāo)樣160份，繁殖成活102份。標(biāo)樣均采自田間成株期自然發(fā)病的葉片，選擇無雜菌污染、病斑呈條狀、夏孢子新鮮飽滿的病葉。

1.1.2 小麥條銹菌鑒別寄主

小麥條銹菌鑒別寄主采用全國通用的19個鑒別品種，分別是Fulhard、保春128、Trigo Eurdka、抗引655、維爾、豐產(chǎn)3號、南大2419、阿勃、丹麥1號、尤皮2號、洛夫林13、早洋、中四、洛夫林10、Su 11、Hybrid 46、T.speltaalbum和貴農(nóng)22，以小麥條銹病感病品種銘賢169作為對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)樣的分離、繁殖和保存

小麥條銹菌生理小種鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)部太白小麥條銹病菌重點野外科學(xué)觀測試驗站進行。在溫室將感病品種銘賢169種植于7 cm×7 cm×7 cm小花盆中，待第一葉完全展開時，將葉片脫蠟，分別接種經(jīng)處理活化后的條銹菌標(biāo)樣的夏孢子(每葉片接一個夏孢子堆)，黑暗保濕(9±2 ℃)24 h后移至溫室潛育(14±3 ℃)發(fā)病。到葉片可以看到夏孢子時，每盆只留一棵發(fā)病較好的苗，編號，隔離培養(yǎng)。發(fā)病充分后收集夏孢子并轉(zhuǎn)接到新種的銘賢169上進行擴繁。剩余的夏孢子置于干燥器中4 ℃短期保存?zhèn)溆?，封口袋中真?80 ℃長期保存。

1.2.2 標(biāo)樣鑒定

按套種植鑒別寄主，每盆種植4個鑒別寄主(每個角種一個品種)并編號，5盆為一套，以感病品種銘賢169為對照。待第一葉完全展開時，把上述繁殖好的菌種采用撒粉法進行接種，經(jīng)黑暗保濕24 h后，置于溫度14±3 ℃、光照時間14 h、光照強度8 000～10 000 lx溫室中培養(yǎng)16～18 d。待其發(fā)病充分后按小麥條銹病0～4級分級標(biāo)準(zhǔn)記錄侵染型，其中0～2級為抗病(R)，3～4級為感病(S)[8-9]。根據(jù)鑒別寄主對被鑒定小麥條銹菌的侵染型，確定其生理小種類型[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

毒性分析采用二元歸類法，即將無毒反應(yīng)型(0～2級)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0，有毒反應(yīng)型(3～4級)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為1?；诤唵纹ヅ涞南嗨凭仃嚕肞OPGENE version 1.32 軟件計算下列統(tǒng)計數(shù)據(jù)：觀察等位基因數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分率、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)。根據(jù)Nei’s遺傳距離，用Ntsys軟件對條銹菌群體進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥條銹菌生理小種鑒定結(jié)果

102份小麥條銹病標(biāo)樣共監(jiān)測到已知小種(類型)19個(表1、表2)，分別為CYR21、CYR29、洛13-8，Hybrid46類群中的CYR31、CYR32、Hy-7、Hy-8，Su11類群中的CYR33、Su11-4、Su11-23、Su11-24、Su11-26、Su11-32、Su11-41，以及貴農(nóng)22類群的Gui22-3、Gui22-6、Gui22-9、Gui22-13、Gui22-14，這些小種(類型)出現(xiàn)頻率依次為0.98%、0.98%、0.98%、0.98%、17.65%、0.98%、1.96%、40.20%、2.94%、0.98%、0.98%、0.98%、0.98%、4.90%、0.98%、0.98%、6.86%、0.98%、7.84%。

Su11類群中，CYR33出現(xiàn)頻率最高，為40.20%，其分布流行范圍最廣，是2015年湖北省小麥條銹菌優(yōu)勢小種；其次是Su11-41，頻率為4.90%，有一定分布范圍；Su11-4、Su11-23、Su11-24、Su11-26、Su11-32等類型的出現(xiàn)頻率在0.98%～2.94%之間，頻率較低。

Hybrid 46類群中，CYR32出現(xiàn)頻率最高，為17.56%，在本年度監(jiān)測到的所有條銹菌小種中僅次于CYR33，且分布范圍較廣，也是湖北省小麥條銹菌優(yōu)勢小種；其他小種(類型)CYR31、Hy-4、Hy-8出現(xiàn)頻率在0.98%～1.96%之間。

表1 2015年湖北省小麥條銹菌生理小種監(jiān)測結(jié)果Table 1 Identification results of Puccnia striiforms f.sp triciti races in Hubei province in 2015

本年度首次從湖北省小麥條銹病標(biāo)樣中監(jiān)測到感染鑒別寄主貴農(nóng)22的貴農(nóng)22類群，其中，以Gui22-9和Gui22-14為主要小種類型，具有與 CYR32和 CYR33類似的致病特點，毒性較強，其出現(xiàn)頻率總和達到了17.64%；Gui22-3、Gui22-6、Gui22-13的出現(xiàn)頻率均為0.98%。

2.2 小麥條銹菌群體毒性多態(tài)性分析

2.2.1 小麥條銹菌生理小種毒性多樣性分析

群體毒性多樣性分析結(jié)果顯示(表3)，在物種水平上，觀察等位基因數(shù)為1.79，有效等位基因數(shù)目為1.28，Nei’s基因多樣性指數(shù)為 0.19，Shannon’s信息指數(shù)為 0.31；在群體水平上，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.054～0.270，平均為0.131 0；Shannon’s指數(shù)為0.082～0.408，平均為0.196；多態(tài)性位點數(shù)目為3～15，平均為6.83;多態(tài)性位點百分率為15.79%～78.95%，平均為35.96%。說明湖北省小麥條銹菌毒性多樣性比較豐富，毒性多樣性在不同區(qū)域間存在一定程度的差異，宜城的群體毒性多樣性最高，枝江的群體毒性多樣性最低。

2.2.2 小麥條銹菌不同種群間的毒性遺傳距離和遺傳一致度

由表4可知，6個群體的小麥條銹菌群體Nei’s 遺傳一致度為0.950～0.989，Nei’s 遺傳距離為0.011～0.051，可見湖北省不同地區(qū)小麥條銹菌群體間的毒性遺傳距離較小，相似程度較高。枝江和襄陽間的毒性遺傳結(jié)構(gòu)相似性(0.989)最高，遺傳距離(0.011)最?。幌尻柡褪呷后w間的相似性(0.950)最低，遺傳距離(0.051)最遠。

2.3 小麥條銹菌群體毒性聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示(圖1)，湖北省小麥條銹菌群體的毒性遺傳相似系數(shù)值為0.97時，6個群體可聚為兩個大的類群，十堰、宜城聚為第一個大類群，荊州、荊門、襄陽、枝江聚為第二個大類群。在毒性遺傳相似系數(shù)值為0.98時，第二個大類群又可分為三個小類群，即荊州為一個類群，荊門為一個類群，襄陽和枝江為一個類群，其中，襄陽和枝江遺傳相似系數(shù)值為0.99，可認(rèn)為其毒性結(jié)構(gòu)相同。

表2 2015年湖北省小麥條銹菌生理小種的類型及其在鑒別寄主上的反應(yīng)Table 2 Races and their infection types on the differential hosts in Hubei province in 2015

Na:觀察等位基因數(shù)；Ne:有效等位基因數(shù)；H:基因多樣性指數(shù)；I:Shannon’s信息指數(shù)；NP:多態(tài)性位點數(shù)；PL:多態(tài)性位點百分率。

Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;H:Nei’s gene diversity;I:Shannon’s information index;NP:Number of polymorphic loci;PL:Percentage of polymorphic loci.

表4 Nei’s無偏遺傳距離和遺傳一致度Table 4 Nei’s unbiased genetic distance and genetic identity

對角線以上為遺傳一致度，對角線以下為遺傳距離。

Genetic identity is above the diagonal,and genetic distance is below the diagonal.

圖1 2015年湖北6個小麥條銹菌群體毒性聚類分析樹狀圖

3 討 論

小麥條銹病是大區(qū)流行病害，湖北省冬麥區(qū)冬季氣候條件有利于條銹病菌的繁殖，因此，該地區(qū)為小麥條銹菌的“冬繁區(qū)”。同時，該地區(qū)也是病菌自西北向黃淮海廣大麥區(qū)傳播的“橋梁”地區(qū)，在全國小麥條銹病大區(qū)流行中具有特殊作用[11]。因此，明確該地區(qū)小麥條銹菌的群體結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，對于整個黃淮麥區(qū)小麥條銹病的預(yù)測和防治都有至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，2015年湖北省小麥條銹菌優(yōu)勢小種與2013年相比[12]仍然是CYR33和CYR32，其分布范圍廣，出現(xiàn)頻率高，致病性強，是湖北省當(dāng)前小麥生產(chǎn)上的主要流行小種。值得關(guān)注的是，2014年之前湖北省尚未監(jiān)測到能夠感染鑒別寄主貴農(nóng)22(含有小麥抗條銹病基因 Yr26/Yr24)的貴農(nóng)22致病類型，2015年湖北省標(biāo)樣中，首次監(jiān)測到貴農(nóng)22致病類型，分別為Gui22-3、Gui22-6、Gui22-9、Gui22-13和Gui22-14，其出現(xiàn)頻率總和達到17.64%，表明貴農(nóng)22菌系已經(jīng)從甘肅省、四川省傳播到了湖北省小麥產(chǎn)區(qū)，對湖北省小麥主栽品種已經(jīng)構(gòu)成了潛在的威脅。在今后，應(yīng)當(dāng)注意減少或者淘汰含有 Yr26/Yr24抗病基因小麥品種的種植面積，控制貴農(nóng)22菌系的出現(xiàn)頻率，減輕其危害。

本研究通過對湖北省小麥條銹菌群體毒性多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，湖北省小麥條銹菌群體毒性多樣性比較豐富，且毒性多樣性在不同區(qū)域間存在一定程度的差異,造成差異的原因可能有以下幾個方面：環(huán)境條件的影響，不同地區(qū)種植品種的不同或品種布局復(fù)雜程度的影響，采樣局限性的影響，不同地區(qū)接受不同菌源(甘肅隴南菌源和四川盆地菌源)的影響，也可能是上述2個或多個影響因子共同作用的結(jié)果。

Nei’s遺傳一致度結(jié)果表明，群體間毒性遺傳相似性系數(shù)較高，表明群體間存在廣泛的遺傳交流。其中，枝江和襄陽間的毒性遺傳相似性系數(shù)為0.99，為群體間最高，襄陽和十堰群體間的相似性最低。依據(jù)遺傳一致度繪制的毒性聚類圖，枝江和襄陽劃為一個類群，但兩地區(qū)的地理距離很遠；襄陽和十堰毒性遺傳距離較遠，分別處在不同的類群中，但兩地區(qū)的地理區(qū)域相對較近。表明條銹菌群體的毒性遺傳結(jié)構(gòu)與地理距離的遠近沒有相關(guān)性，進一步說明地理距離并不是導(dǎo)致條銹菌群體毒性多樣性的根本原因。這與樊 玉等[12]對鄂西北小麥條銹菌群體毒性結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致。

條銹菌不僅毒性多樣性，而且條銹菌生理小種具有高度變異性，新小種的出現(xiàn)往往會使原有抗病基因喪失抗性，造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，因此，監(jiān)測條銹菌群體結(jié)構(gòu)變異動態(tài)具有重要意義。但在我國目前通用的鑒別寄主中，絕大多數(shù)鑒別寄主對條銹菌主要小種均感病，已經(jīng)不能滿足及時監(jiān)測小麥條銹菌小種變異的要求。因此，應(yīng)根據(jù)目前小麥條銹菌群體結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)品種含有的基因類型及時調(diào)整我國小麥條銹菌鑒別寄主，或使用近等基因系或單基因系鑒別寄主[13]來更好的監(jiān)測小麥條銹菌變異動態(tài)。

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Population Structure and Diversity Analysis ofPucciniastriiformisf.sp.triticiin Hubei Province in 2015

WANG Qiao1,MA Jinjuan1,YANG Lijun2,LI Qiang1,WANG Baotong1

(1.College of Plant Protection,Northwest A&F University/State Key Laboratory for Crop Stress Biology in Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Hubei Academy of Agricultural Sciences,Research Institute of Plant Protection Soil and Fertilizer,Wuhan,Hubei 430064,China)

In order to clarify races composition and dynamics ofPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst) in Hubei province,102 wheat stripe rust samples collected from six cities in Hubei province in 2015 were identified on Chinese differential hosts.Nineteen Pst races were detected.Among these races,CYR33 and CYR32 were the most prevalent races in Hubei province,ranking the first(40.2%) and second(17.65%),respectively.The other Pst races mainly belonged to Suwon 11 group,Hybrid 46 group and Guinong 22 group.In addition,Guinong 22 group was firstly detected in Hubei province,and its occurrence frequency was up to 17.64%.The group diversity study showed that Nei’s genetic diversity index(H) and Shannon’s information index(I) were 0.19 and 0.31 at the species level,respectively,indicating that the toxicity diversity of Pst races in Hubei province is high.UPGMA cluster analysis indicated that the similarity coefficient of genetic toxicity of Pst population ranges from 0.95 to 0.99,which suggested high similarity coefficient,short genetic distance and extensive communication among different groups,and there is no correlation between the toxicity genetic structure of tripe rust population and the geographical distance.

Hubei province;Pucciniastriiformisf.sp.tritici; Races;Population structure; Virulence diversity

時間：2017-01-16

2016-06-25

2016-07-26

國家“973”計劃項目(2013CB127700)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD19B04-12)；國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-3-1)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃項目(B07049)

E-mail：qiaozi@nwsuaf.edu.cn

李 強(E-mail:qiangli@nwsuaf.edu.cn);王保通(E-mail:wangbt@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S332

A

1009-1041(2017)02-0275-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170116.1835.034.html