高 璐，谷 巖，陳 峰

人體體液多肽組質(zhì)譜分析方法優(yōu)化

高 璐，谷 巖，陳 峰

人體體液中多肽組成分近年來(lái)獲得越來(lái)越多的關(guān)注。 不同體液作為不同器官、細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下的分泌產(chǎn)物，對(duì)其成分特定改變的監(jiān)測(cè)具有無(wú)創(chuàng)性、早期、敏感特異地預(yù)測(cè)人體健康狀態(tài)、疾病變化、治療療效、藥物毒性等體內(nèi)變化方面的潛力。 而體液成分多而復(fù)雜，體液系統(tǒng)易受干擾，富集、提取分離出相對(duì)分子質(zhì)量整體較低的多肽組成分并進(jìn)行特定多肽成分的準(zhǔn)確計(jì)量非常重要而具有挑戰(zhàn)性。目前對(duì)人體體液多肽組成分的研究多采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法。 對(duì)此方法的實(shí)驗(yàn)偏差進(jìn)行分析、提出改進(jìn)方法，可以提高人體體液多肽組成分分析的準(zhǔn)確性。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)人體體液多肽組成分進(jìn)行質(zhì)譜分析是人體健康狀況臨床檢查的新思路，其中特定多肽組成分有潛力成為監(jiān)測(cè)人體相關(guān)部位健康狀況的生物標(biāo)志物。

體液；多肽組；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法；偏差；優(yōu)化

人體體液多肽組成分的準(zhǔn)確分析，特定多肽成分的準(zhǔn)確計(jì)量很有希望幫助體液多肽組成分監(jiān)測(cè)成為人體內(nèi)病理等許多變化的新方法。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 法對(duì)人體體液中多肽組成分進(jìn)行質(zhì)譜分析是人體相關(guān)部位健康狀況臨床檢查的新思路[1-4，7-13]，體液中特定多肽組成分有潛力成為監(jiān)測(cè)人體健康狀況的生物標(biāo)志物[10-32]，也必將成為今后的研究熱點(diǎn)之一。 現(xiàn)將人體體液多肽組成分 MALDITOF MS 法分析實(shí)驗(yàn)偏差及操作優(yōu)化方面的研究進(jìn)行綜述。

1 MALDI-TOF MS 法實(shí)驗(yàn)偏差

偏差主要來(lái)源于樣本外部及樣本內(nèi)部2個(gè)方面。 樣本外部偏差因素主要由樣本蛋白/多肽提取，樣本保存、離心分離、凍融，樣本收集時(shí)機(jī)，基質(zhì)液種類(lèi)選擇、準(zhǔn)備，實(shí)驗(yàn)儀器性能等方面的偏差導(dǎo)致產(chǎn)生；而樣本內(nèi)部偏差因素主要是樣本受血液及白細(xì)胞干擾，樣本來(lái)源個(gè)體的年齡及性別差異等方面的偏差導(dǎo)致產(chǎn)生。

1.1 外部偏差

1.1.1 樣本蛋白 /多肽提取 3 名健康個(gè)體[1]，上午 10 時(shí)(餐后至少 2 h)取等量唾液入唾液收集管，每毫升唾液中加入 10 μL 苯甲基磺酰氟 (0.1 mol/ L) 、1 μL 胃蛋白酶抑制劑(1 mmol/L) 、20 μL 蛋白酶抑制因子混合物(P2714)，均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；之后樣本分為離心組與非離心組 2 組，每組各300 μL 初始量，各組內(nèi)再等分試樣分別以有機(jī)溶劑沉淀法、硫酸銨沉淀法、酸沉淀法進(jìn)行樣本沉淀；部分條件處理組加以超濾步驟，之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析顯示對(duì)于蛋白組成分的獲取:①離心組以酸沉淀提取較未以酸沉淀提取組蛋白獲取量高，乙腈、胍、硫酸銨處理組蛋白獲取率較低；②所有提取方法組中非離心組均比離心組蛋白獲取量高，尤其是乙醇組與丙酮組。 三氟乙酸組與乙腈/超濾組中離心組與非離心組蛋白獲取量相似。 對(duì)于多肽組成分的獲取，除乙腈組、乙醇組、丙酮組外，其他所有組中離心前進(jìn)行提取步驟者多肽組成分獲取量高，其中碳酸氫銨/超濾組結(jié)果最佳。

1.1.2 樣本凍融周期、保存條件 獲取條件相同的腦脊液樣本[2]進(jìn)行 3 組實(shí)驗(yàn)，第 1 組:實(shí)驗(yàn)樣本分別于 4、21 ℃ 分別培養(yǎng) 0、1、3、6、24、48、72 h；第 2 組:樣本收集后分別于-80、-196 ℃條件下保存 4 周；第3 組:樣本保存過(guò)程中分別經(jīng)凍融周期 1、2、3 次。之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析顯示，4 ℃ 培養(yǎng)樣本可穩(wěn)定保存 72 h 無(wú)降解；而 21 ℃培養(yǎng)樣本 24 h 后即出現(xiàn)多肽組成分差異(信噪比改變)，48 h 后差異更加明顯。 -80、-196 ℃ 條件下樣本保存，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度結(jié)果未觀察到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本經(jīng)凍融周期3次較1次相關(guān)信號(hào)少量改變，可分辨質(zhì)譜信號(hào)少量減少。

1.1.3 樣本收集時(shí)機(jī) 樣本(尿液)[3]分別來(lái)自一次晨尿、二次晨尿，之后的樣本保存、離心分離、試樣等分、固相萃取、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。 質(zhì)譜分析顯示，一次晨尿與二次晨尿樣本質(zhì)譜信號(hào)存在顯著不一致，存在部分質(zhì)荷比信號(hào)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。唾液樣本的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)相似，樣本收集時(shí)機(jī)的不同可能導(dǎo)致樣本成分的顯著改變，進(jìn)而增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。

1.1.4 基質(zhì)液的種類(lèi)及準(zhǔn)備方法 實(shí)驗(yàn)樣本為標(biāo)準(zhǔn)樣本(多肽/蛋白混合物)及條件相同的人血清樣本[4]，各分 4 組實(shí)驗(yàn)，分別使用 α-氰基-4-羥基肉桂酸( α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA) 、芥子酸(sinapinic acid， SA) 、 龍膽 酸 (2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB)、2，5-二羥基苯乙酮(2，5-dihydroxyacetophenone，DHAP)4 種基質(zhì)，均為德國(guó) Merck 公司產(chǎn)品；每組內(nèi)每種基質(zhì)分別采用晾干后點(diǎn)樣法(drieddroplet， DD)[5]、 樣 本 /洗 樣 (sample/wash method，SM)[6]2 種基質(zhì)準(zhǔn)備方法。 之后的試樣等分、固相萃取、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。 質(zhì)譜分析顯示:①DD 法于 4 種基質(zhì)中都獲得更多同質(zhì)結(jié)晶型，質(zhì)譜結(jié)果更優(yōu)。 ②SM 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果整體較 DD 法差，可重復(fù)性、再現(xiàn)性、分辨率、信噪比均較低，背景干擾較大，檢測(cè)能力較低。 ③從整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析來(lái)看，CHCA 作為基質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最差。 就可重復(fù)性和再現(xiàn)性而言，SA基質(zhì)結(jié)合 DD 法(SA/DD)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最穩(wěn)定。 ④DHB/ DD法實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。 此結(jié)果與之前研究結(jié)果不符，原因可能在于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是背景干擾的大小而非峰值數(shù)量的多少。⑤從整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析來(lái)看，DHAP/DD 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)(樣本為人血清時(shí))，其使用的限制條件在于準(zhǔn)備步驟較復(fù)雜。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器性能 對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器性能的分析主要在于儀器的質(zhì)量準(zhǔn)確性及批內(nèi)、批間重復(fù)性[2]。 利用相對(duì)峰強(qiáng)存在 10 種特征信號(hào)的腦脊液樣本，分別采用疏水作用色譜 C8 磁珠( 德國(guó) Autoflex Bruker 公司) ，弱陽(yáng)離子交換磁珠(MB-weak cation exchange，MB-WCX，德國(guó) Autoflex Bruker 公司) 及銅離子固相金屬離子親和色譜磁珠( 德國(guó) Autoflex Bruker 公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。 質(zhì)譜分析顯示:應(yīng)用不同磁珠，測(cè)得信號(hào)數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；批內(nèi)再現(xiàn)性、批間可重復(fù)性越好(即批內(nèi)、批間變異系數(shù)越小)，信噪比越大，即質(zhì)譜分析結(jié)果越優(yōu)。

1.2 內(nèi)部偏差

1.2.1 樣本受血液及白細(xì)胞干擾 相同條件的人腦脊液樣本[2，17]分組實(shí)驗(yàn)，分別加入不同量血液或白細(xì)胞，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析結(jié)果與未污染樣本的結(jié)果比較顯示:①質(zhì)核比1 000 ～ 10 000，血紅蛋白最高樣本 (155 μmol/ L)只出現(xiàn) 25 個(gè)峰值，與未加入血液樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較 89 個(gè)峰值未出現(xiàn)； ②血紅蛋白濃度 0.075 μmol/L 以下質(zhì)譜結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加入血液對(duì)質(zhì)譜結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③經(jīng)過(guò)離心分離，白細(xì)胞污染對(duì)質(zhì)譜結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 樣本來(lái)源個(gè)體的年齡及性別差異 相同條件的 123 份人血清樣本[7]被分為 A(＜30 歲)、B(30 ～50 歲)、C(＞50 歲)3 組及男性、女性 2 組，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI 板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析顯示無(wú)監(jiān)督集群圖示，＜30 歲與≥30 歲的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分散于2個(gè)集群中，表明其質(zhì)譜分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；男性、女性 2 組質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 操作優(yōu)化

對(duì) MALDI-TOF MS 法的部分實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行優(yōu)化可減少實(shí)驗(yàn)偏差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而提高質(zhì)譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。 目前，已有的對(duì)實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化的研究方面包括樣本高豐度蛋白去除、樣本凝固時(shí)間及溫度選擇、凍融周期的控制、樣本裝液量(磁珠樣本量比)、樣本基質(zhì)液準(zhǔn)備、MALDI靶板準(zhǔn)備、激光照射能量的選擇等。

2.1 樣本高豐度蛋白去除 相同條件人唾液樣本[8]，其中高豐度蛋白主要包括唾液 α-淀粉酶、白蛋白、免疫球蛋白，高豐度蛋白掩蓋低豐度蛋白的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)信號(hào)。 樣本收集后:①對(duì)白蛋白、IgG 進(jìn)行去除、捕獲、洗脫(SwellGelò Blue Kit，ProteoPrepò Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit) ；②對(duì)唾液α-淀粉酶進(jìn)行親和去除、捕獲、洗脫(淀粉酶去除裝置，臨時(shí)專(zhuān)利號(hào) 60915204)；③對(duì)樣本中總蛋白濃度進(jìn)行粗測(cè)( 蛋白質(zhì)定量試劑，美國(guó) Bio-Rad Bradford公司)。 之后樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。 質(zhì)譜分析顯示，去除高豐度蛋白可通過(guò)去除高豐度蛋白對(duì)低豐度蛋白信號(hào)的覆蓋、掩蓋以發(fā)現(xiàn)更多低豐度蛋白成分信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。

2.2 樣本凝固時(shí)間及溫度選擇 相同條件的人血清樣本[7，9]，血清分離出血漿步驟分組實(shí)驗(yàn)，等分樣本為 3 個(gè)溫度條件組，分別于 4、20、37 ℃ 條件下，每組再等分樣本為 4 組分別凝固 0.5、1、2、24 h，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析顯示:①20 ℃ 時(shí)前 3 組峰值數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而 24 h 組峰值數(shù)量最少。 而主成分分析顯示 20℃條件 4 組成分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(偏析)，隨凝固時(shí)間增加可檢測(cè)出新的多肽成分。②質(zhì)譜信號(hào)總強(qiáng)度隨凝固時(shí)間增加而增加，質(zhì)譜分析結(jié)果轉(zhuǎn)優(yōu)，而若凝固過(guò)程在質(zhì)譜分析前一天進(jìn)行，則質(zhì)譜信號(hào)總強(qiáng)度顯著減小，質(zhì)譜分析結(jié)果較差。 ③20 ℃條件較 4、37 ℃條件所獲峰值數(shù)量及質(zhì)譜信號(hào)總強(qiáng)度更高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更優(yōu)。主成分分析顯示不同溫度成分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(偏析)。

2.3 凍融周期的控制 相同條件的人血清樣本[7]，樣本保存過(guò)程中經(jīng)凍融周期 0、1、2、4 次，之后離心分離、試樣等分、MALDI板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。 質(zhì)譜分析顯示，質(zhì)譜信號(hào)峰值數(shù)量及總強(qiáng)度均隨凍融周期增加而減?。恢鞒煞址治鲲@示 0次組與其他 3組間成分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(偏析)。 樣本保存過(guò)程中經(jīng)凍融周期次數(shù)越少，質(zhì)譜分析結(jié)果越優(yōu)。

2.4 樣本裝液量(磁珠樣本量比) 相同條件的人血清樣本[7]分 4 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組等量陰陽(yáng)離子交換磁珠 10 μL，樣本量分別為 3、5、8、10 μL，樣本保存、離心分離、試樣等分、MALDI 板測(cè)定位點(diǎn)、質(zhì)譜采集步驟各組樣本實(shí)驗(yàn)條件均相同。質(zhì)譜分析顯示:①不同樣本量組質(zhì)譜峰值數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②不同樣本量組質(zhì)譜信號(hào)總強(qiáng)度有差異，8 μL組結(jié)果最優(yōu)；③主成分分析顯示 4組間成分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 偏析) 。 8 μL 血清達(dá)到 10 μL 磁珠的最高承載能力；10 μL 血清對(duì)于 10 μL 磁珠過(guò)飽和，可能導(dǎo)致一些多肽成分由于多肽結(jié)合位點(diǎn)有限產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)而結(jié)合能力降低，從而致質(zhì)譜分析結(jié)果變差。唾液樣本的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)相似，合適的磁珠樣本量比可最大限度充分利用磁珠承載能力，優(yōu)化質(zhì)譜分析結(jié)果。

2.5 基質(zhì)液準(zhǔn)備 因質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)所用有機(jī)基質(zhì)溶液中包含不穩(wěn)定成分，易快速揮發(fā)[9]，應(yīng)每日新鮮配制基質(zhì)液，現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天基質(zhì)液應(yīng)封閉處理并避光保存。

2.6 MALDI靶板準(zhǔn)備 ①環(huán)境相對(duì)濕度應(yīng)是 30%～60%，溫度 18 ～ 25 ℃[9]，結(jié)晶步驟中避免靶板受空調(diào)直吹；②測(cè)定位點(diǎn)步驟避免滴樣出現(xiàn)氣泡[9]；③洗脫液位點(diǎn)需完全干燥后再滴入基質(zhì)液，但為減少氧化，應(yīng)避免干燥后至滴入基質(zhì)液非操作時(shí)間[9]。

2.7 照射激光能量選擇 范圍內(nèi)適度調(diào)整，照射激光能量越低，質(zhì)譜信號(hào)的分辨率越高[9]。

3 操作優(yōu)化流程

目前文獻(xiàn)研究?jī)H有對(duì)人血清樣本的 MALDI-TOF MS 法操作優(yōu)化后流程[7]，尚無(wú)包括唾液在內(nèi)的其他人體體液樣本的操作優(yōu)化流程(表 1)。

表1 人體體液樣本的操作優(yōu)化流程

當(dāng)然，優(yōu)化流程的方法不是唯一的，實(shí)驗(yàn)步驟的具體流程也不是唯一的。 在正式實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，研究者還需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度、質(zhì)譜儀性能、樣本特點(diǎn)等客觀條件適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)步驟中各項(xiàng)條件的具體細(xì)節(jié)，以使實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差及影響盡量減小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。 如樣本與磁珠比例，不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可能會(huì)因磁珠批號(hào)等存在差異而使最適樣本磁珠比例有所改變，研究者可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以摸清實(shí)驗(yàn)條件，確定個(gè)性化的最優(yōu)操作細(xì)節(jié)。

4 結(jié)論

作者對(duì)人體體液多肽組成分應(yīng)用 MALDI-TOF MS法進(jìn)行質(zhì)譜成分分析實(shí)驗(yàn)中可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差因素及部分實(shí)驗(yàn)操作方法的改進(jìn)優(yōu)化進(jìn)行總結(jié)。 發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)譜分析結(jié)果的實(shí)驗(yàn)外部、內(nèi)部偏差因素，對(duì)可改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行優(yōu)化，可提高人唾液中多肽組成分質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性。 應(yīng)用 MALDITOF MS 法對(duì)人體體液多肽組成分進(jìn)行質(zhì)譜分析是人體健康狀況臨床檢查的新思路，其中特定多肽組成分有潛力成為監(jiān)測(cè)人體相關(guān)部位健康狀況的生物標(biāo)志物。 對(duì) MALDI-TOF MS 法實(shí)驗(yàn)步驟及操作細(xì)節(jié)的偏差、優(yōu)化考量及研究證實(shí)是今后研究需重點(diǎn)關(guān)注的方面。

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Recent research on optimized mass spectrum analysis of human body fluids peptidome

GAO Lu1，2， GU Yan1，2， CHEN Feng1，3
(1.Beijing Oral Digital Medical Key Laboratory， National Oral Digital Medical Technology and Materials Engineering Laboratory， Beijing 100081， China； 2.Department of Orthodontic，Peking University Hospital of Stomatology， Beijing 100081， China； 3.Central Laboratory，Peking University Hospital of Stomatology， Beijing 100081， China)

Peptidome composition of human body fluid has gained more and more attention. Different human body fluids are excreta or secreta of different organs or cells in physiological or pathological status.By monitoring specific changes of peptidome composition in human body fluids， we can potentially be able to predict human health status， development of diseasess， curative effects of treatments and pharmaceutical toxicity and so on noninvasively early， sensitively and specifically. However， compositions of human body fluids are complicated， the body fluid systems are vulnerable to many factors， so it’ s a big challenge to concentrate， extract and separate peptidome composition which are of low molecular weight and measure specific peptidome composition accurately.Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method is widely used in researches of peptidome composition of human body fluids at present.Analysis of deviation in experiments and proposing of improved operation can increase accuracy when analyzing peptidome composition in human fluids.Analysing peptidome of human fluids by MALDI-TOF MS method is a new thought of examining human physical conditions clinically.Specific peptidome compositions in human fluids have the potential to be new biomarkers to monitor human physical condition of related body parts.

Body fluid； Peptidome； Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)method； Deviation； Optimize

Q592；Q516

A

2095-3097(2017)01-0060-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.016

2016-10-17 本文編輯:徐海琴)

100081 北京，口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(高 璐，谷 巖，陳 峰)；100081 北京，北京大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科(高 璐，谷 巖)，中心實(shí)驗(yàn)室(陳 峰)

谷 巖，E-mail:guyan96＠126.com；陳 峰，E-mail:molec ulecf＠gmail.com