李苗苗， 楊霄旭，楊朝霞，向雙林，韓 梅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

HIV-1型Nef基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

李苗苗， 楊霄旭，楊朝霞，向雙林，韓 梅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

為了構(gòu)建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重組表達(dá)載體，利用PCR從pNL4-3質(zhì)粒上擴(kuò)增 HIV-1型Nef基因，獲得Nef基因完整的編碼區(qū)，構(gòu)建可表達(dá)Nef蛋白的 pEB-myc-nef重組表達(dá)載體.經(jīng)鑒定正確后，利用 LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè) Nef蛋白的瞬時(shí)表達(dá).為了建立穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系，采用G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，篩選出單克隆細(xì)胞系.擴(kuò)大培養(yǎng)克隆細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)Nef的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平，經(jīng)長(zhǎng)達(dá)60 d的傳代，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供了細(xì)胞模型.

Nef基因；SW480細(xì)胞；G418；穩(wěn)定細(xì)胞系

艾滋病(AIDS)全稱為“獲得性免疫缺陷綜合征”，是一種由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病.RNA干擾(RNAi)是細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制，具有高效性、特異性和副作用小的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于抗HIV-1 治療研究是近來(lái)研究熱點(diǎn)[1-2].RNAi抑制HIV-1的復(fù)制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干擾HIV-1病毒的RNA，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道幾乎HIV-l的所有基因都可作為干擾的靶點(diǎn)：如LTR[3]，gag[4-5]，pol[6]，vpu[7]，vif[5]，tat[8]和env[9]等基因.RNAi還可以將干擾的位點(diǎn)靶定到細(xì)胞上與HIV病毒感染密切相關(guān)的受體蛋白、輔助受體蛋白或其他的一些細(xì)胞因子[10].

負(fù)調(diào)控因子(negative factor，Nef) 是人免疫缺陷病毒( HIV) 附屬蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量小，柔韌性大，核心結(jié)構(gòu)呈球形.Nef 不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調(diào) CD4，主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHC Ⅱ)和 CD28 分子，在對(duì)抗宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用.Nef 可增強(qiáng)病毒的復(fù)制和感染性，抑制 HIV 感染細(xì)胞的凋亡，在 HIV 致病機(jī)制方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用.基于Nef在體內(nèi)的致病機(jī)制，多種抗HIV-1病毒策略被提出，使Nef成為潛在的HIV-1靶點(diǎn).本文試圖構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HIV-1型Nef蛋白的SW480細(xì)胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供細(xì)胞模型.

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌、pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒、pNL4-3質(zhì)粒、SW480細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與NotⅠ購(gòu)自ThermoFisher公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒試劑購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；G418購(gòu)自Sigma公司；小鼠源Anti-myc抗體、內(nèi)參蛋白actin抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG均購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；其他常規(guī)試劑與耗材均購(gòu)自于上海生工生物科技有限公司.

1.2 引物設(shè)計(jì)合成

參照pNL4-3質(zhì)粒上HIV-1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0軟件設(shè)計(jì)的引物如下：Nef正向引物,5′-CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC-3′；Nef反向引物,5′-ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC- 3′.分別在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3 HIV-1型Nef片段的擴(kuò)增

以pNL4-3質(zhì)粒為模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)HIV-1型Nef基因編碼區(qū)，全長(zhǎng)640 bp.PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL4-3質(zhì)粒 1 μL，正向引物和反向引物(10 nmol/L)各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，根據(jù)片段大小用DNA純化試劑盒進(jìn)行切膠回收.

1.4 HIV-1型Nef真核表達(dá)載體構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物和pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定.

1.5 重組表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

SW480細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和100×青霉素-鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，接種量為2×106個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)使其密度達(dá)80%～90%.參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將8 μg pEB-myc-nef重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒的SW480細(xì)胞為對(duì)照，48 h后收集細(xì)胞.冰上收獲細(xì)胞，經(jīng)裂解后離心取上清，加入上樣緩沖液和DTT煮沸10 min.用10%SDS-PAGE膠分離細(xì)胞蛋白，上樣20 μg.110 V恒壓80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上.將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%的脫脂奶粉過(guò)夜封閉.再孵育小鼠抗myc的抗體，充分洗膜，隨后孵育HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B液混勻，5 min后平鋪于膜的蛋白面，通過(guò)顯影儀(Tonon公司)顯影拍照.

1.6 SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

將SW480細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，使用不同濃度G418(0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L)的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天更換培養(yǎng)基，連續(xù)觀察12 d，確定全部細(xì)胞死亡的最低濃度，即為最佳的G418篩選濃度.

1.7 穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞株的篩選和鑒定

SW480細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)16 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至匯合度達(dá)80%時(shí)，將0.8 μg pEB-myc-nef質(zhì)粒在20μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞.48 h后將細(xì)胞1∶10稀釋轉(zhuǎn)種24孔板，同時(shí)加入終濃度為900 mg/L的G418，同時(shí)設(shè)pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照.2～3 d換液1次，待大部分細(xì)胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培養(yǎng)液維持壓力篩選3周，挑出單個(gè)細(xì)胞集落，有限稀釋到96孔板進(jìn)行單克隆篩選，篩選出的單克隆細(xì)胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培養(yǎng)皿擴(kuò)大培養(yǎng).擴(kuò)大培養(yǎng)到一定量后，進(jìn)行冷凍保存.剩余的一些細(xì)胞連續(xù)傳代60 d以上(約30代)，取一部分細(xì)胞進(jìn)行Nef的RT-PCR檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，確保細(xì)胞株的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果

2.1 HIV-1Nef基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用PCR方法擴(kuò)增Nef基因產(chǎn)物，將20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)1條約640 bp大小的片段(如圖1)，片段大小符合預(yù)期，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出HIV-1Nef基因.

2.2 真核表達(dá)載體pEB-myc-Nef的鑒定

2.2.1 轉(zhuǎn)化菌中Nef基因的PCR鑒定 將上述過(guò)夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取4個(gè)克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌夜PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，與預(yù)期的條帶大小吻合.

注：M:DNA marker; 1-4：PCR product of HIV-1 Nef gene圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel eletrophoresis of PCR product

注：M:DNA marker; 1-4:PCR products of different clones圖2 轉(zhuǎn)化菌中Nef基因的PCR分析Fig.2 PCR analysis of nef fragment in transferred bacteria

注：M:DNA marker; 1:pEB-myc-Nef; 2-3:pEB-myc-Nef/BamH Ⅰ+Not Ⅰ圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pEB-myc-Nef的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme identification of the recombinant plasmid pEB-myc-nef

2.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pEB-myc-Nef的雙酶切鑒定

重組載體pEB-myc-Nef經(jīng)BamH Ⅰ和NotⅠ雙酶切后，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，一條為10 223 bp大小的pEBMulti-neo-myc條帶(圖3)，說(shuō)明載體構(gòu)建正確.

PCR擴(kuò)增的Nef全長(zhǎng)DNA序列插入pEBMulti-neo-myc載體，測(cè)序結(jié)果與pNL4-3質(zhì)粒報(bào)道的Nef序列相符，表明Nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.

2.3 SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

使用G418終濃度分別為0～1 000 mg/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SW480細(xì)胞，觀察細(xì)胞的死亡情況.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加藥后1 d，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的變化；持續(xù)篩選7 d，大量細(xì)胞開(kāi)始脫落死亡，貼于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞逐漸變圓；至12 d，細(xì)胞全部死亡(圖4).確定SW480細(xì)胞全部死亡的最低濃度為900 mg/L.

圖4 G418 毒性試驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)變化(10×)Fig.4 Cells morphology by G418 toxicity test(10×)

2.4Nef基因在SW480細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEB-myc-Nef和載體質(zhì)粒pEBMulti-neo-myc分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，收集細(xì)胞，裂解后上樣進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示.重組質(zhì)粒pEB-myc-Nef轉(zhuǎn)染細(xì)胞中在約29 000處有特異性條帶，而載體質(zhì)粒pEBMulti-neo-myc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中沒(méi)有，表明HIV-lNef基因在SW480細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá).圖中actin蛋白為內(nèi)參蛋白.

2.5 穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系的鑒定

pEB-myc-Nef質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，經(jīng)G418抗性篩選3周后，在顯微鏡下挑選出了4個(gè)細(xì)胞集落，經(jīng)傳代擴(kuò)增后，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到Nef的表達(dá)，而空載對(duì)照SW480細(xì)胞則未檢測(cè)到Nef基因的表達(dá)(圖6)，并且在連續(xù)傳代60 d后，通過(guò)RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)，仍可以檢測(cè)到Nef基因的轉(zhuǎn)錄(圖7)與表達(dá)(圖8).以上結(jié)果表明，已篩選到穩(wěn)定表達(dá)HIV-1型Nef基因的SW480細(xì)胞株.

注：1:pEBMulti-neo-myc;2:pEB-myc-Nef圖5 Western blot鑒定Nef蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Western blot analysis of Nef Protein expression in SW480

注：1-4:Nef protein expression in four cell clones transfected with recombinant expression plasmid; 5:non-Nef protein expression in SW480 cells transfected with contrast empty plasmid圖6 Western Blot鑒定G418篩選3周后Nef蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Western Blot analysis of Nef protein expression in SW480 screened by G148 for three weeks

注：M:DNA marker; 1-3:SW480 cells transfected with recombinant expression plasmid; 4-5:SW480 cells transfected with contrast empty plasmid圖7 RTPCR檢測(cè)連續(xù)培養(yǎng)60天后單細(xì)胞克隆中Nef基因的轉(zhuǎn)錄Fig.7 RT-PCR analysis of Transcription of Nef gene in SW480 cells cultured for a further 60 days

圖8 Western Blot檢測(cè)連續(xù)培養(yǎng)60 d后單細(xì)胞克隆中Nef基因的表達(dá)Fig.8 Western Blot analysis of Nef gene expression in SW480 cells continued for a further 60 days

3 討論

RNAi通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)來(lái)沉默基因這種技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有極重要的意義，RNAi不僅可以作為基因功能研究與評(píng)價(jià)的方法工具，它還可以作為一種基因治療的手段.2001年Tusehl研究組開(kāi)創(chuàng)了RNAi技術(shù)治療人類疾病的新途徑.將RNAi用于病毒性疾病的治療和預(yù)防研究取得了一些顯著的效果，比如乙肝病毒(HBV)[13]、丙肝病毒(HCV)[14]、人乳頭瘤病毒(HPV)[15]、EB病毒[16].將RNAi應(yīng)用于艾滋病治療的文獻(xiàn)也不計(jì)其數(shù)[17]，這些研究都為HIV-1的基因治療提供了很好的參考依據(jù).但是RNAi還無(wú)法應(yīng)用于臨床治療艾滋病，阻礙這一進(jìn)程的是RNAi的傳遞模式.

2006年，向雙林等提出利用修改過(guò)的非治病性細(xì)菌在體內(nèi)及體外定向傳遞shRNA到靶細(xì)胞中以發(fā)揮干擾作用.他們將這種依賴細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)稱之為T(mén)ransKingdom RNAi (tkRNAi)[18].該研究的最終目的是將這種依賴細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)應(yīng)用到干擾艾滋病病毒的基因研究中，試圖探尋更有效的RNAi傳遞方法，為將RNAi應(yīng)用到臨床上治療艾滋病提供理論依據(jù).由于HIV病毒基因的RNAi干擾實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV-1型病毒蛋白的細(xì)胞模型顯得至關(guān)重要.

本實(shí)驗(yàn)從pNL4-3質(zhì)粒上擴(kuò)增出Nef基因，隨后與pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒共同經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化構(gòu)建成pEB-myc-nef真核表達(dá)質(zhì)粒.通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序分析證明nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMulti-neo-myc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.利用 LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞，收集蛋白，利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到 Nef蛋白的瞬時(shí)表達(dá).然后利用G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，首次建立了穩(wěn)定表達(dá)HIV-1型Nef基因的SW480細(xì)胞系，為研究tkRNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供了細(xì)胞模型.

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(編輯 WJ)

Recombinant Vector Construction and Stable Cell Line Establishment for Expression of HIV-1NefGene

LIMiao-miao,YANGXiao-xu,YANGZhao-xia,XIANGShuang-lin,HANMei*

(College of Life Sciences,Hunan Normal University,Changsha 410081,China)

In order to construct the recombinant expression vector and establish the stable SW480 cell line for expression of HIV-1Nefgene， HIV-1Nefgene was amplified from the plasmid of pNL4-3 by PCR,and its full ORF was cloned into pEBMulti-neo-myc vector to form the vector pEB-myc-nef.This vector expressing Nef and myc proteins was confirmed by sequencing analysis.The transient expression of Nef in SW480 cells transfected with the recombinant plasmid via LipofectamineTM2000 was then determined by Western Blot.Furthermore,SW480 cells transfected with pEB-myc-nef were screened by G418.Positive cell clones were cultivated and subcultured,and thenNeftranscriptional level and protein expression level were determined by RT-PCR and Western Blot,respectively.After continuous passage for 60 days,the SW480 cells transfected with the recombinant plasmid stably express Nef protein by G418 pressure selection,which will provide an appropriate cell model in order to study the application of RNAi in the treatment of AIDS.

Nefgene; SW480 cell; G418; stable cell line

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.01.005

2016-03-14

湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2014FJ2006)；長(zhǎng)沙市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目(K1205221-31)

* 通訊作者,E-mail：hanmei@hunnu.edu.cn

Q78；R392

A

1000-2537(2017)01-0031-06