楊偉克+唐芬芬+劉增虎

摘要：為研究琥珀蠶在高溫和低溫脅迫條件下，血淋巴超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性變化規(guī)律。對(duì)5齡琥珀蠶第3天幼蟲分別進(jìn)行38 ℃高溫和4 ℃低溫脅迫處理3 h，以室溫26 ℃飼養(yǎng)作對(duì)照，在處理停止后0、3、6、9、12 h取血淋巴，測(cè)定SOD和CAT的活性變化。結(jié)果表明：38 ℃高溫處理，引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢(shì)，在處理停止后3 h分別達(dá)到1個(gè)峰值86.30 U/mL和108.15 U/mL，隨后逐漸減弱，最終與對(duì)照組持平。4 ℃低溫脅迫，SOD活性也是在處理停止后3 h出現(xiàn)1個(gè)峰值59.30 U/mL，隨即開始逐漸減弱，在12 h接近對(duì)照組；而CAT酶活性先下降，并低于對(duì)照，在3 h出現(xiàn)1個(gè)最低值11.09 U/mL，隨后開始升高，在6 h達(dá)到1個(gè)峰值88.68 U/mL，隨后再逐漸下降并接近對(duì)照。

關(guān)鍵詞：琥珀蠶；血淋巴；低溫處理；高溫處理；超氧化物歧化酶；過(guò)氧化氫酶

中圖分類號(hào)：S885.9；S881.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0153-02

琥珀蠶（Antheraea assamensis）屬鱗翅目（Lepidoptera）大蠶蛾科（Saturniidae）柞蠶屬（Antheraea）的絹絲昆蟲，是一種珍貴的野蠶資源，主要分布在印度東北部和印緬邊境地區(qū)，印度人稱其為姆珈蠶（muga silkworm）[1-2]。在印度，琥珀蠶未被完全馴化，目前還不能完全在室內(nèi)飼養(yǎng)，只能在野外放養(yǎng)[3]。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所于2006年在云南發(fā)現(xiàn)琥珀蠶，并對(duì)云南野生琥珀蠶進(jìn)行人工馴化飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)幾年的探索，成功實(shí)現(xiàn)了琥珀蠶的室內(nèi)馴化飼養(yǎng)，并對(duì)其形態(tài)特征、生物學(xué)特性及人工馴養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)作了相應(yīng)的研究[4]。

目前對(duì)琥珀蠶的研究主要集中在生物學(xué)特征、飼養(yǎng)技術(shù)及繭絲性能和蠶絲蛋白等方面，至今還未見有關(guān)逆境條件下，琥珀蠶保護(hù)酶活性變化及生理生化特性的研究報(bào)道。本研究人工模擬逆境環(huán)境，對(duì)琥珀蠶5齡第3天幼蟲分別進(jìn)行高溫和低溫處理，測(cè)定其在高溫和低溫條件下SOD和CAT的活性變化，解析高溫和低溫對(duì)琥珀蠶生理生化影響的內(nèi)在機(jī)理，為后續(xù)培育琥珀蠶抗逆新品種提供生理生化鑒定參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

琥珀蠶幼蟲，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供，在室內(nèi)26 ℃飼養(yǎng)至5齡第3天。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分為3組；高溫處理組、低溫處理組與對(duì)照組。選擇體型大小相近的5齡第3天琥珀蠶幼蟲，分別置于38 ℃高溫和4 ℃低溫條件下沖擊3 h，以室溫26 ℃正常飼養(yǎng)為對(duì)照。

取樣方法：分別取高溫和低溫沖擊后0、3、6、9、12 h琥珀蠶幼蟲，用脫脂棉蘸取75%乙醇進(jìn)行體表消毒、晾干，冰上取已用75%乙醇消毒過(guò)的2號(hào)昆蟲針刺其腹足，擠壓蟲體使血淋巴流出，收集到預(yù)先加有苯基硫脲的5 mL離心管中，4 ℃條件下，8 000 r/min離心5～8 min，收集上清液，用于酶活測(cè)定。每5頭蠶的血淋巴收集到1個(gè)離心管為1個(gè)重復(fù)，每次取樣均設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組同時(shí)取材。

1.3 主要試劑及儀器

SOD測(cè)試盒和CAT測(cè)試盒（江蘇南京建成生物科技有限公司）；冰醋酸（上海聯(lián)試化工）；Thermo Scientific BioMate 3S紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)）。

1.4 血淋巴保護(hù)酶活性測(cè)定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定 按照SOD測(cè)定試劑盒操作。其原理是通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O-2· ），后者經(jīng)氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。酶活定義：1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U）。計(jì)算公式：總SOD活力（U/mL）=（D1-D2）÷D1÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。式中：D1指對(duì)照管的吸光度；D2指測(cè)定管的吸光度。

1.4.2 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定 參照CAT測(cè)定試劑盒操作。其原理是：過(guò)氧化氫酶（CAT）能分解H2O2生成H2O和O2，反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止，剩余H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測(cè)定其變化量，可計(jì)算CAT活力。酶活定義：1 mL樣品1 s分解 1 μmol H2O2的量為1個(gè)活力單位。計(jì)算公式：樣品CAT活力（U/mL）=（D1-D2）×271×[1/（60×取樣量）]×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。式中：D1指對(duì)照管的吸光度；D2指測(cè)定管的吸光度；271為斜率的倒數(shù)；60為反應(yīng)時(shí)間60 s。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理及分析 采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，同時(shí)利用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴SOD活性變化

經(jīng)高溫38 ℃和低溫4 ℃處理后，在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比，琥珀蠶血淋巴SOD活性均是先升高，在3 h達(dá)到1個(gè)峰值，隨后逐漸減弱。其中38 ℃高溫處理停止后，SOD活性上升較快，上升幅度也比較大；而低溫4 ℃處理停止后，SOD活性上升幅度相對(duì)較弱（圖1）。

2.2 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴CAT活性變化

由圖2可以看出，高溫38 ℃和低溫4 ℃均能引起琥珀蠶血淋巴過(guò)氧化氫酶CAT活性升高。其中38 ℃高溫處理停止后，CAT酶活性在3 h達(dá)到1個(gè)峰值（最高值達(dá)到 108.15 U/mL），隨后開始逐漸減弱，在12 h接近對(duì)照。而 4 ℃ 低溫處理停止后，CAT酶活性在3 h出現(xiàn)降低，并低于對(duì)照，隨后開始逐漸升高，在6 h達(dá)到1個(gè)峰值（最高值 88.68 U/mL），然后再逐漸降低至接近對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）是昆蟲體內(nèi)重要的2種保護(hù)酶[5]，兩者在維護(hù)生物體內(nèi)自由基代謝平衡過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，并在一定程度上影響生物的抗逆能力[6-7]。CAT的主要功能是參與活性氧代謝過(guò)程，它可以催化H2O2分解為H2O和O2，避免羥自由基的產(chǎn)生，防止其進(jìn)一步氧化而破壞生物大分子[8]。SOD能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，將其歧化為H2O2和O2，H2O2再經(jīng)過(guò)CAT作用轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而達(dá)到清除超氧陰離子自由基的目的，維持細(xì)胞和機(jī)體的正常生理活動(dòng)[9]。

在對(duì)家蠶和柞蠶等的研究表明，高溫或低溫脅迫均能引起蠶體自由基的過(guò)量積累，而蠶體內(nèi)的SOD和CAT在清除自由基過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[10-12]。夏潤(rùn)璽等測(cè)定了低溫和高溫條件下，柞蠶血淋巴CAT活性變化，研究結(jié)果表明，4 ℃ 低溫處理柞蠶，其血淋巴CAT活性先下降，然后持續(xù)升高，并高于對(duì)照，處理時(shí)間越長(zhǎng)，CAT上升幅度越大；用高溫40、43、46 ℃分別處理柞蠶幼蟲，均能引起柞蠶血淋巴CAT活性升高[10-11]。袁燕萍等比較了高溫36 ℃沖擊對(duì)家蠶抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明，高溫沖擊48～72 h，5齡家蠶幼蟲中腸組織SOD和CAT活性均有一定程度的升高，并且隨沖擊時(shí)間的的延長(zhǎng)其活性顯著增加[12]。另外，吳蕾等研究了溫度、光照周期和光照波長(zhǎng)等環(huán)境因子對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲西藏飛蝗抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明，在低溫處理下，SOD和CAT活性隨溫度的降低均出現(xiàn)升高趨勢(shì)，在5 ℃條件下，均顯著高于對(duì)照；在高溫脅迫下，各部位的SOD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，超過(guò)35 ℃后兩者的活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高到45 ℃時(shí)，SOD和CAT活性均低于對(duì)照[13]。

室內(nèi)飼養(yǎng)琥珀蠶幼蟲的最適溫度為26～32 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于琥珀蠶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至造成死亡[14]。本研究結(jié)果表明，琥珀蠶在38 ℃高溫處理停止后，相對(duì)于 26 ℃ 飼養(yǎng)的對(duì)照組，SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高的趨勢(shì)，達(dá)到1個(gè)峰值，隨后逐漸減弱，最終與對(duì)照組持平。在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，SOD與CAT活性上升幅度均高于低溫4 ℃處理組。這暗示38 ℃高溫脅迫誘導(dǎo)蠶體產(chǎn)生的自由基可能高于低溫4 ℃處理組，自由基濃度的持續(xù)升高，進(jìn)一步引起保護(hù)酶SOD和CAT的活性升高。

低溫4 ℃刺激停止后，琥珀蠶血淋巴SOD也是先出現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨著時(shí)間的推移，逐漸下降，最終恢復(fù)到對(duì)照組酶活水平；而CAT活性先出現(xiàn)急劇下降，隨后升高達(dá)到1個(gè)峰值后，再逐漸減弱，在12 h時(shí)接近對(duì)照。4 ℃低溫刺激琥珀蠶，其CAT酶活先出現(xiàn)下降趨勢(shì)，分析認(rèn)為很有可能是低溫4 ℃脅迫導(dǎo)致琥珀蠶機(jī)體自身營(yíng)養(yǎng)代謝水平減弱甚至短暫失調(diào)，在一定程度上阻礙了CAT的合成。

本研究結(jié)果顯示：高溫38 ℃和低溫4 ℃脅迫均能引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性在一定時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)先上升后減弱的趨勢(shì)。保護(hù)酶SOD和CAT起清除自由基的作用，其活性隨著自由基濃度的變化而變化[6]。不論是高溫還是低溫等逆境刺激對(duì)蠶體都會(huì)或多或少造成一定的損傷，打破正常的生理活動(dòng)，引發(fā)蠶體產(chǎn)生過(guò)量自由基。在這種情況下，蠶體需要大量保護(hù)酶用來(lái)清除過(guò)量的自由基，維持機(jī)體正常的生命代謝活動(dòng)。隨著時(shí)間的推移，蠶體生理機(jī)能逐漸趨于正常，產(chǎn)生的自由基濃度逐漸降低，保護(hù)酶活性也開始下降，

兩者最終維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

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