陳全戰(zhàn)　張邊江　王立科等

摘要：為探究深海嗜熱菌（Thermophile thermus）中鐵離子超氧化物歧化酶Fe-SOD基因（TtSOD）與植物耐鹽性的關(guān)系，對(duì)該基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了TtSOD基因過量表達(dá)載體，并將該過量表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化煙草中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)615 bp，是典型的Fe-SOD。轉(zhuǎn)TtSOD基因煙草中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性顯著提高，而丙二醛（MDA）含量顯著降低；轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)率、葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著提高。本研究的結(jié)果表明植物過表達(dá)TtSOD基因，提高了轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽能力，為選育作物耐鹽性新品種提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：深海嗜熱菌（Thermophile thermus）；超氧化物歧化酶（SOD）；耐鹽性；轉(zhuǎn)基因煙草

中圖分類號(hào)：Q78；Q939 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4766-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.027

Abstract： In order to explore the relations between salt resistance and TtSOD in plant， the sequence of the whole TtSOD gene was analyzed. The excessive expression vector involving to TtSOD gene was constructed， and then the vector was transformed into a tobacco. The results showed that the gene （Fe-SOD） is 615 bp in length. The activity of Super oxide dismutase（SOD）， Peroxidase （POD）and Catalase （CAT） in transgenic tobacco increased significantly， while the Malonyldialdehyde（MDA） contents decreased remarkably. Chlorophyll and carotenoid contents and germination rate of seeds in transgenic tobacco increased observably. These results suggested that the salt-tolerance ability in transgenic tobacco improved strongly by excessive expression of TtSOD gene. Transgenic crop with TtSOD gene would be one of feasible means for crop breeding of salt resistance.

Key words： Deep-sea thermophilic bacterium； Super oxide dismutase（SOD）； salt tolerance； transgenic tobacco

土壤的鹽漬化嚴(yán)重制約著農(nóng)作物的生長(zhǎng)以及土地資源的利用。高鹽逆境脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的超氧自由基，使生物體的細(xì)胞膜通透性增加，膜脂過氧化，從而造成植株生理功能的減弱或衰退[1]。超氧化物歧化酶（SOD）通過改善活性氧的清除能力，在植株受到逆境脅迫時(shí)能夠減少活性氧的積累，減輕對(duì)植物在逆境情況下的傷害作用[2]。

SOD是由多基因家族編碼的，是一種金屬酶類，可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD 4類。Fe-SOD起源較其他SOD早，主要存在于原核生物中，是相對(duì)保守的蛋白質(zhì)。Fe-SOD能催化歧化超氧離子，將生物體的活性氧控制在一個(gè)穩(wěn)定的有利范圍[3]。李素霞等[4]發(fā)現(xiàn)Fe-SOD的熱穩(wěn)定性要比其他種類SOD的熱穩(wěn)定性高。轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)Fe-SOD可以顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化性[5，6]。Kardinahl等[7]從一種高嗜溫性菌株（archaeon Acidianus ambivalens）中純化并鑒定了一種耐高溫的Fe-SOD；姜曉杰等[8]在畢氏酵母中成功表達(dá)了鈍頂螺旋藻Fe-SOD；曾秀存等[9]分析了白菜型油菜Fe-SOD的基因功能，發(fā)現(xiàn)Fe-SOD在初期低溫脅迫下基因上調(diào)表達(dá)。這些研究已證明，在逆境條件、環(huán)境脅迫等條件下SOD基因表達(dá)量比較高，可以不同程度提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力。

TtSOD是從深海嗜熱菌JM1（inshore hot spring Thermophile thermus JM1）中分離克隆到的一個(gè)SOD基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贔e-SOD類。為了研究TtSOD基因?qū)煵莸绒r(nóng)作物抗鹽性的影響，本研究構(gòu)建了過量表達(dá)載體，以煙草為轉(zhuǎn)基因受體材料，分析鹽脅迫下轉(zhuǎn)TtSOD基因煙草的各項(xiàng)生理指標(biāo)，包括SOD、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）含量，葉綠素和類胡蘿卜素含量和種子萌發(fā)率，為研究轉(zhuǎn)SOD基因提高植物耐鹽性方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

本賽姆氏煙草品種（Nicotiana tabacum L.）、根癌農(nóng)桿菌EHA105、大腸桿菌DH5α、植物雙元表達(dá)載體pBI121（報(bào)告基因?yàn)镚FP），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。TtSOD基因（HM990157.1）由浙江大學(xué)章曉波老師惠贈(zèng)。

1.2 TtSOD基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)TtSOD基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)過量表達(dá)載體構(gòu)建引物：SOD-XbaⅠ：5′-CGCTCTAGAATGCCGTACCCGTTCAAGC-3′SOD-BamHⅠ：5′-CGCGGATCCAACAGGCCTTCTTGAAGAA-3′（下劃線為酶切位點(diǎn)）。

為了目的基因能夠與報(bào)告基因GFP通讀，對(duì)TtSOD基因終止子進(jìn)行了核苷酸替換。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增得到的目的條帶連入經(jīng)相同內(nèi)切酶雙酶切的pBI121載體，而后用雙酶切和測(cè)序法對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證。

1.3 TtSOD基因過量表達(dá)載體（35S：SOD）進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化

用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草培育轉(zhuǎn)基因植株，采集種子用于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草的陽(yáng)性鑒定

經(jīng)卡那霉素篩選的陽(yáng)性植株，進(jìn)行基因組PCR鑒定。上游引物為：SOD-1（5′-ATGCCGTACCCGTT

CAAGC-3′）；下游引物為：SOD-2（5′-TCAGGCCTTCTTGAAGAACTCTTCG-3′），反應(yīng)的退火溫度為60 ℃。

RT-PCR鑒定：提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用SOD-1和SOD-2引物對(duì)TtSOD基因在煙草中mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了鑒定。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)的耐鹽性分析

分別選擇T1代轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草各100粒種子置于含150 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)上培養(yǎng)，重復(fù)3次，種子萌發(fā)后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草鹽脅迫下苗期生理指標(biāo)測(cè)定

選取培養(yǎng)6周的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草幼苗，用150 mmol/L的NaCl溶液每隔2 d澆灌一次，持續(xù)8 d后，取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相同葉位葉片 （倒3葉），進(jìn)行耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

采用氮藍(lán)四唑（Nitrobiue tetrazolium，NBT）光化學(xué)還原法測(cè)定SOD活性[10]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性[11]；采用硫代巴比妥酸比色法[12]測(cè)定MDA含量；CAT活性和葉綠素含量參照文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定；采用紫外分光光度法測(cè)定類胡蘿卜素含量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組克隆載體TtSOD：PMD18鑒定與序列分析

以構(gòu)建好的重組克隆載體TtSOD：PMD18質(zhì)粒為模板，以SOD-XbaⅠ和SOD-BamHⅠ為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，預(yù)計(jì)可擴(kuò)增出633 bp的特異條帶，并且此條帶含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。隨機(jī)挑選6個(gè)單菌落，除了1號(hào)外其他5個(gè)都在633 bp處有目的大小的清晰條帶。為了在目的基因TtSOD兩側(cè)引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，檢測(cè)引入酶切位點(diǎn)的正確性，隨機(jī)選取了經(jīng)上述PCR鑒定為陽(yáng)性克隆的單克隆進(jìn)行了測(cè)序，如圖2所示，目的基因序列以及酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的序列沒有發(fā)生任何突變，并且TtSOD的終止密碼子突變成了非終止密碼子，以便于后續(xù)試驗(yàn)的的同源閱讀。以上兩種方法均證實(shí)了TtSOD基因兩側(cè)成功引入了XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，為構(gòu)建過量表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ)。

2.2 TtSOD轉(zhuǎn)基因煙草T1代的篩選與鑒定

通過PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ，成功構(gòu)建了TtSOD基因的過量表達(dá)載體（圖3）。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將TtSOD基因整合到煙草基因組中。經(jīng)卡那霉素篩選和PCR（SOD-1和SOD-2引物）鑒定為陽(yáng)性的T0代轉(zhuǎn)基因煙草，單株收獲T1代種子。將T1代種子平鋪于含有50 mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，攜帶有目的基因的植株能正常生長(zhǎng)；未攜帶目的基因的植株，即使萌發(fā)也會(huì)慢慢黃化而死亡。

以T1代轉(zhuǎn)基因煙草提取的DNA為模板，以野生型煙草為對(duì)照，以SOD-1和SOD-2為引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行基因組PCR鑒定，結(jié)果顯示630 bp左右目的條帶（圖4），7～9號(hào)泳道為煙草轉(zhuǎn)基因株系，而6號(hào)泳道對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)整合到基因組中。

以T1代轉(zhuǎn)基因煙草提取葉片RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以野生型煙草為對(duì)照，以SOD-1和SOD-2為引物對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行mRNA表達(dá)水平鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出630 bp左右的目的條帶（圖4），2～5號(hào)泳道為煙草轉(zhuǎn)基因株系，而1號(hào)泳道對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3 鹽脅迫下TtSOD轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)情況分析

經(jīng)RT-PCR鑒定為陽(yáng)性的T1代轉(zhuǎn)基因煙草中，選取S62和S88株系作為后續(xù)研究對(duì)象。從圖5可以看出，經(jīng)過150 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的萌發(fā)都受到不同程度的抑制，轉(zhuǎn)基因煙草的萌發(fā)率普遍高于對(duì)照野生型煙草。轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)率達(dá)到98%，野生型煙草的萌發(fā)率在72%左右。未經(jīng)任何處理的對(duì)照試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的萌發(fā)率沒有明顯差異。說(shuō)明經(jīng)NaCl處理后轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性明顯提高。

2.4 TtSOD轉(zhuǎn)基因煙草苗期耐鹽生理指標(biāo)的測(cè)定

超氧化物酶是需氧生物普遍存在的一種金屬酶，它與過氧化物酶和過氧化氫酶等酶協(xié)同作用，在清除超氧自由基對(duì)膜系統(tǒng)的傷害方面起著重要作用。在150 mmol/L的 NaCl脅迫下，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草的SOD、POD和CAT活性明顯提高（圖6 A、圖6 B和圖6 C），MDA含量降低（圖6D），這說(shuō)明在煙草中過量表達(dá)細(xì)菌TtSOD基因能夠提高煙草對(duì)鹽分脅迫的耐受性。

植物在受到逆境脅迫后影響植物的光合作用、呼吸作用，從而影響葉綠素含量。因此，在鹽脅迫處理下，研究葉綠素含量可以反映植物耐受鹽脅迫的程度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量均明顯增加（圖7），表明轉(zhuǎn)基因煙草在逆境脅迫下其生理功能得到了改善。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，許多植物的SOD基因相繼被廣泛研究。朱虹琳等[15]克隆了蓮Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的cDNA序列；高健等[16]分析了特異種質(zhì)煙草HZNH的Fe-SOD 基因功能和表達(dá)；葉煜輝等[17]獲得抗逆性的賴草Fe-SOD的EST序列長(zhǎng)207 bp，其編碼的60個(gè)氨基酸與多種植物Fe-SOD氨基酸序列的同源性達(dá)到60%以上。本研究的SOD基因是從耐熱細(xì)菌（Thermophile thermus）基因組分離到的，該基因核苷酸序列長(zhǎng)度為615 bp，TtSOD基因具有Fe-SOD類基因典型的功能。

眾所周知，植物在逆境脅迫條件下產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引發(fā)膜脂過氧化，從而對(duì)植物造成傷害。研究表明，在鹽堿、干旱、高溫、冷凍等逆境條件下SOD基因表達(dá)量比較高，可以不同程度提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力[18]。SOD通過清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧、減少細(xì)胞內(nèi)部的活性氧累積，對(duì)于增強(qiáng)植株的耐鹽等抗逆能力具有重要作用。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，使TtSOD基因在煙草中過量表達(dá)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草中SOD、POD和CAT活性顯著增加，而MDA含量明顯降低，表明過量表達(dá)TtSOD基因提高了煙草的耐鹽能力。

葉綠素在植物光合作用中起吸收和轉(zhuǎn)化光能的作用，葉綠素a和b分別是光合作用的主要色素和輔助色素，其含量在一定程度上體現(xiàn)了植物光合作用能力的大小。植物受到逆境脅迫時(shí)會(huì)影響到葉綠素的含量。因此，葉綠素含量下降可以看成是植物受害后的生理指標(biāo)反應(yīng)之一。在本研究中，轉(zhuǎn)基因煙草葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量明顯高于未轉(zhuǎn)基因煙草的含量，表明TtSOD基因可以有效降低葉綠素的生物降解，使轉(zhuǎn)基因煙草在高鹽脅迫下受到的傷害較小，從而提高煙草對(duì)鹽脅迫的抗性。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌SOD基因在煙草中過量表達(dá)后，不僅抗氧化能力顯著增強(qiáng)，其光合色素含量也顯著提高，表明轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽脅迫能力明顯提高，這為煙草耐鹽品種的選育提供了一種新的育種資源。至于其轉(zhuǎn)Fe-SOD基因煙草提高耐鹽的作用機(jī)理，還有待進(jìn)一步研究。

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