王濤+曹麗萍+杜金梁

摘要：用地塞米松構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型，并探索最佳建模濃度，初步探究地塞米松致建鯉肝臟脂變的作用機(jī)理。建鯉活體取肝，用振蕩切片機(jī)制備厚度為300 μm的建鯉肝切片，27 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h。將試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和空白對(duì)照組，試驗(yàn)組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培養(yǎng)基于 27 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，空白對(duì)照組用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間，培養(yǎng)結(jié)束后，收集試驗(yàn)組和空白對(duì)照組中上清液和肝切片。參照試劑盒說明檢測(cè)上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，肝切片勻漿中三磷酸腺（ATP）、總蛋白（TP）含量，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）含量以及脂肪酸合成酶（FAS）活性。結(jié)果顯示，建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，ATP含量變化不大；當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.93 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的其他指標(biāo)與空白對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）。由此說明，用濃度為3.93 mg/L地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h可以成功構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型。

關(guān)鍵詞：建鯉；肝切片；地塞米松；脂變；脂肪肝；糖皮質(zhì)激素

中圖分類號(hào)： S941.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0146-04

肝臟作為生物體內(nèi)的重要器官，在能量代謝和物質(zhì)循環(huán)中具有重要作用，同時(shí)也是蛋白質(zhì)、脂肪合成的重要場(chǎng)所[1]。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，魚類脂肪肝和肝腫大普遍存在，但目前還沒有較好的治療方法，患病魚類品質(zhì)下降，抗病能力降低，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖健康持續(xù)發(fā)展。魚類脂肪肝的成因復(fù)雜，普遍認(rèn)為，養(yǎng)殖條件下投喂?fàn)I養(yǎng)不均衡的配合飼料（如高糖、高脂）以及養(yǎng)殖期間投喂過量，造成肝臟脂類物質(zhì)代謝發(fā)生障礙，脂肪沉積于肝臟的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過脂肪轉(zhuǎn)移的速度，導(dǎo)致甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)異常沉積[2]。然而，有關(guān)高等哺乳動(dòng)物的研究表明，脂肪肝的形成與糖皮質(zhì)激素慢性升高有密切聯(lián)系[3]。許多研究證實(shí)，糖皮質(zhì)激素影響肝臟脂肪代謝，誘導(dǎo)脂肪肝和肝腫大[4-6]；過多的脂肪沉積是糖皮質(zhì)激素造成脂肪肝和肝腫大的主要原因[7]。

集約化養(yǎng)殖條件下，魚類受多種應(yīng)激因子刺激。當(dāng)應(yīng)激原存在時(shí)，下丘腦-腦垂體-腎間組織軸受到刺激，使促腎上腺皮質(zhì)激素（adreno cortico tropic hormone，簡稱ACTH）分泌增加，ACTH作用于腎間組織，從而引起糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）分泌增加，導(dǎo)致血液中糖皮質(zhì)激素含量升高[8]。急性應(yīng)激常常導(dǎo)致皮質(zhì)醇含量數(shù)倍甚至數(shù)十倍地增加，而慢性應(yīng)激（如高密度養(yǎng)殖時(shí)的擁擠脅迫等）則使血液中皮質(zhì)醇含量在數(shù)周后仍然保持較高水平，但也有皮質(zhì)醇在1周后恢復(fù)到正常水平[9]。

本試驗(yàn)用不同濃度的地塞米松模擬魚體內(nèi)不同含量的糖皮質(zhì)激素，恒溫培養(yǎng)的建鯉肝切片模擬魚體內(nèi)肝臟，構(gòu)建由地塞米松引起的建鯉肝臟脂變模型。目前，用地塞米松構(gòu)建肝臟脂變模型并不陌生，國內(nèi)外學(xué)者單獨(dú)或與高脂飲食并用構(gòu)建小鼠急性脂肪肝模型，但主要集中在陸生動(dòng)物上，對(duì)水生動(dòng)物研究較少。殷國俊等將孵化出96 h的斑馬魚暴露在添加50 mg/L地塞米松的水中，經(jīng)過24 h后，斑馬魚的肝臟顯著增大了40%，此階段的斑馬魚是卵黃囊為內(nèi)源性營養(yǎng)，表明地塞米松在沒有外源性營養(yǎng)的情況下，可以誘導(dǎo)斑馬魚的肝腫大（注：相關(guān)試驗(yàn)尚未公開發(fā)表）。劉英娟等單獨(dú)使用四氯化碳成功構(gòu)建鯉魚肝細(xì)胞脂變模型，用該模型成功篩選出護(hù)肝中藥枸杞多糖[10]；盧榮華等用脂肪乳劑成功構(gòu)建草魚肝細(xì)胞脂變模型[11]；國外學(xué)者在青鳉魚上成功構(gòu)建肝臟脂變模型，并用該模型成功篩選出護(hù)肝藥物[12]。該試驗(yàn)通過地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h后，成功構(gòu)建建鯉肝臟脂變模型，為篩選相關(guān)治療藥物提供理論模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)用建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng)，體質(zhì)健康無病。將建鯉放入循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)1周，養(yǎng)水溫度為25 ℃，每天定時(shí)定量投喂商品飼料。

1.2 主要試劑和儀器

地塞米松（dexamethasone）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO），購于美國Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate pyruvic transaminase，簡稱GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，簡稱GOT）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，簡稱ATP）、總蛋白（total protein，簡稱TP）、甘油三脂（triglyceride，簡稱TG）、總膽固醇（total cholesterol，簡稱TC）、游離脂肪酸（free fatty acids，簡稱FFA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，簡稱FAS）等試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；振蕩切片機(jī)、723分光光度計(jì)，購自上海欣茂儀器有限公司；酶標(biāo)儀MK3，購自美國Thermo公司。

1.3 建鯉肝切片的制備與培養(yǎng)

無菌條件下，建鯉消毒麻醉后，超凈臺(tái)內(nèi)取出肝臟并置于PBS緩沖液中，持續(xù)通入含95% O2、5% CO2的混合氣體。用PBS緩沖液清洗肝組織3次后，用解剖刀處理成體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝組織塊，2%的低熔點(diǎn)膠包埋，30 min后固定肝組織，振蕩切片機(jī)制備厚度為300 μm的肝切片。將上述肝組織切片置于含1 mL L-15培養(yǎng)基的24孔板中。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組4個(gè)重復(fù)；試驗(yàn)前，各組用L-15培養(yǎng)基27 ℃恒溫箱中預(yù)培養(yǎng)2 h后，吸棄上清?？瞻讓?duì)照組換用新鮮L-15培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，試驗(yàn)組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L 地塞米松的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)束后收集上清液和肝切片。

1.5 建鯉精密肝切片活力檢測(cè)

建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后收集并稱其質(zhì)量，加入9倍體積的沸雙蒸水，制成10%的組織勻漿，沸水中煮 10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按ATP測(cè)試盒說明書測(cè)定三磷酸腺苷含量。

1.6 生化指標(biāo)測(cè)定

地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h后，收集上清液和肝切片。按試劑盒說明書分別測(cè)定TP、FFA、TG、TC的含量，GPT、GOT、FAS活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行整理分析。采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其中，在0.01水平上差異顯著用“**”表示，在0.05水平上差異顯著用“*”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地塞米松對(duì)建鯉肝切片活性的影響

由圖1可知，建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，ATP含量雖然有所降低但差異不顯著（P>0.05）。由此推斷，在該濃度劑量范圍內(nèi)，地塞米松對(duì)建鯉肝切片活性的影響較小。

2.2 地塞米松對(duì)建鯉肝切片抗氧化能力的影響

由圖2可知，隨著地塞米松濃度的增加，超氧化物歧化酶的活性先降低，然后保持相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)?shù)厝姿蓾舛瘸^0.393 0 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著（P<0.01）；當(dāng)濃度超過3.93 mg/L后超氧化物歧化酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.3 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中總蛋白含量的影響

由圖3可知，隨著地塞米松濃度的增加，總蛋白含量先逐漸降低后保持相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)濃度達(dá)到3.930 0 mg/L時(shí)，總蛋白含量達(dá)到最低點(diǎn)；超過該濃度，總蛋白含量保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.4 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中GPT、GOT活性影響

如圖4可知，GPT、GOT的活性隨著地塞米松濃度的升高，先增加后保持相對(duì)穩(wěn)定，在濃度為0.393 0 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；地塞米松濃度達(dá)到并超過3.930 0 mg/L時(shí)，GPT、GOT的活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.5 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中游離脂肪酸（FFA）含量、脂肪酸合成酶（FAS）活性的影響

如圖5可知，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.393 0 mg/L時(shí)，建鯉肝切片勻漿中FFA含量和FAS的活性均出現(xiàn)差異顯著性（P<0.05）；當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.930 0 mg/L 時(shí)差異顯著（P<0.01），超過該濃度時(shí)FFA含量和FAS活性均保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.6 地塞米松對(duì)建鯉肝切片勻漿中TC、TG含量的影響

由圖6可知，建鯉肝切片中TC、TG的含量隨著地塞米松濃度的增加先增加后保持穩(wěn)定，當(dāng)?shù)厝姿蓾舛冗_(dá)到0.393 0 mg/L 時(shí)，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組TC、TG含量差異顯著（P<0.05）；濃度達(dá)到并超過3.930 0 mg/L后，TC、TG含量達(dá)到最大值且保持相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

生物體內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）作為能量轉(zhuǎn)換載體，ATP含量變化直接影響器官的能量代謝[13]。因此，試驗(yàn)中將ATP含量作為評(píng)價(jià)器官活性的重要指標(biāo)。從圖1可以看出，試驗(yàn)組較空白對(duì)照組相比ATP含量有所降低，但差異并不顯著（P>0.05）。由此可以推斷，建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后活性依然良好。試驗(yàn)組ATP降低可能是因?yàn)榈厝姿缮险{(diào)磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，簡稱PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，簡稱G-6-pase）的表達(dá)，促進(jìn)糖異生，并降低組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用效率，抑制線粒體合成ATP[14]。但從本試驗(yàn)的結(jié)果可以推測(cè)這種抑制作用是有限的，試驗(yàn)中的建鯉肝切片活性良好。

SOD作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶[15]，能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧化物自由基，有效防止自由基對(duì)機(jī)體的損害。圖2顯示，隨著地塞米松濃度的增加，試驗(yàn)組中SOD的活性先逐漸降低，然后保持相對(duì)穩(wěn)定，在濃度為0.393 0 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著（P<0.05），當(dāng)濃度達(dá)到并超過3.930 0 mg/L 時(shí)，SOD活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

GPT和GOT是內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶，因此常常通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GPT和GOT活性來判斷細(xì)胞受損程度[16]。本試驗(yàn)中GPT和GOT的活性先是隨著地塞米松濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)到3.930 0 mg/L時(shí)活性達(dá)到最大且保持相對(duì)穩(wěn)定。說明地塞米松對(duì)建鯉肝切片造成了一定的損傷，這種損傷可能與地塞米松促進(jìn)磷脂氧化，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，增加質(zhì)膜的流動(dòng)性，改變細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。

肝臟在蛋白質(zhì)的合成與分解過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，動(dòng)物血漿中的蛋白質(zhì)幾乎全部在肝臟中合成。當(dāng)肝臟受到外界刺激發(fā)生損傷后，功能發(fā)生紊亂，蛋白質(zhì)的合成受阻[17-18]。本試驗(yàn)中建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后，試驗(yàn)組與空白組相比，蛋白質(zhì)含量變化明顯。導(dǎo)致該試驗(yàn)結(jié)果的主要原因可能是地塞米松影響單個(gè)核糖體組裝成多聚核糖體的效率，降低翻譯能力，進(jìn)而減弱蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)而降低蛋白質(zhì)的合成[19]。不僅如此，地塞米松通過激活肝細(xì)胞內(nèi)溶酶體和泛素蛋白酶體蛋白水解途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)降解[20]。由圖3可以看出，當(dāng)?shù)厝姿蓾舛冗_(dá)到3.930 0 mg/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最小值，超過該濃度，蛋白質(zhì)含量保持相對(duì)穩(wěn)定。說明該濃度的地塞米松能有效抑制肝臟對(duì)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解。

肝臟不僅在蛋白質(zhì)代謝過程中起重要作用，而且與脂肪代謝密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，地塞米松可以提高肝X受體（1iver X receptors，簡稱LXRs）mRNA基因的表達(dá)，肝X受體合成分泌增加[21]。肝X受體上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，簡稱SREBPs）基因的表達(dá)，從而間接促進(jìn)脂肪酸合成相關(guān)基因FAS、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，簡稱ACC）基因的表達(dá)[22]。也有研究人員發(fā)現(xiàn)，地塞米松能增加體外培養(yǎng)細(xì)胞中FAS的活性，直接促進(jìn)脂肪酸合成的作用[23]，在本試驗(yàn)中由圖5-b可知，建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，F(xiàn)AS活性明顯上升，并隨著地塞米松濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，在濃度為 3.930 0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值，之后保持相對(duì)穩(wěn)定。

正常情況下，肝臟中的FFA脂化為TG，蛋白質(zhì)與TG結(jié)合成脂蛋白，然后轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟參與血液循環(huán)[24]；TC則一部分氧化生成膽汁進(jìn)入膽囊，另一部分與蛋白質(zhì)結(jié)合后以低密度蛋白和高密度蛋白的形式轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟參與血液循環(huán)[25]。本試驗(yàn)中，由于地塞米松對(duì)建鯉肝切片的誘導(dǎo)作用，F(xiàn)AS合成分泌增加，導(dǎo)致肝臟中FFA含量升高，過多的FFA對(duì)肝臟具有毒害作用，而造成“初次打擊”[26]；此外，F(xiàn)FA通過線粒體β氧化產(chǎn)生過氧化物ROS，再次對(duì)肝臟產(chǎn)生毒害作用而產(chǎn)生“二次打擊”[27]。在地塞米松濃度達(dá)到3.930 0 mg/L后，建鯉肝切片因遭2次“打擊”受損程度最為明顯，試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著（P<0.01）。此外，肝臟中的TG含量隨FFA含量增加而增加，TC含量也隨肝臟中蛋白質(zhì)的減少而增加。肝臟中FFA、TG、TC含量異常變化最終導(dǎo)致肝臟脂肪代謝異常而脂變，甚至演變成脂肪肝。

4 結(jié)論

通過本試驗(yàn)得出如下結(jié)論：地塞米松對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪代謝具有重要調(diào)節(jié)作用。用濃度為3.930 0 mg/L地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝肝切片12 h能成功構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型。

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