吳宗耀，張建超，彭祿庭，韓奇鵬

（1.湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

H5亞型禽流感病毒的研究與應(yīng)用

吳宗耀1，張建超1，彭祿庭1，韓奇鵬2

（1.湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

禽流感病毒一直威脅著水禽養(yǎng)殖業(yè)、哺乳動(dòng)物及人類健康。文章主要從H 5Nx亞型AIV流行現(xiàn)狀、H 5亞型禽流感病毒檢測(cè)方法、H5亞型AIV疫苗候選株的構(gòu)建及鑒定和不同H5亞型AIV疫苗的研究與應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述，為進(jìn)研究H5Nx亞型AIV提供理論參考。

H 5亞型；禽流感；流感病毒；研究進(jìn)展

引起禽流感爆發(fā)主要病原之一的H5N1亞型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)，是造成家禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的病毒。誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物和禽類產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要兩種抗原是神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，它們都位于流感病毒顆粒表面的囊膜上[1]。預(yù)防AIV感染的主要措施有傳統(tǒng)的重組活載體疫苗和全病毒滅活疫苗及新型具有更高安全性的病毒樣顆粒 (Virus-like parricles，VLPs)等疫苗免疫[2]。

1 H5Nx亞型AIV流行現(xiàn)狀

1.1 H 5N 2亞型AIV流行情況

Xu等[3]1996年在我國廣東省水禽中首次發(fā)現(xiàn)H5N1亞型高致病性AIV。1997年在中國香港活禽市場和東南亞禽群爆發(fā)了高致病性H5N1流感病毒。2004年在臺(tái)灣、日本、越南等首次報(bào)道感染H5N1。2004年東南亞地區(qū)累計(jì)已經(jīng)有60個(gè)國家發(fā)現(xiàn)禽類中存在流行性H5N1流感病毒。2005年HPAIH5N1在中國西部青海湖區(qū)爆發(fā)水禽感染事件，致使大面積野禽死亡[4]。隨著時(shí)間的推移，H5N1通過與H9N2、H6N6、H12N8及其他亞型流感病毒基因重組，生成其中毒株具有高致病性特征的新基因型的H5亞型AIV，如在全球流行很廣的H5N2、H5N6、H5N8[5]。

1.2 H 5N 2亞型AIV流行情況

具有高低兩種致病性的H5N2亞型AIV，低致病性一般存在野鳥中，在家禽中會(huì)變異成HPAIV[6]。由于H5N2與H5N1和H9N2亞型有AIV重組現(xiàn)象，所以H5N2亞型AIV與H5N1和H9N2的HA和NA基因相同。Zhao等[7]2012年發(fā)現(xiàn)重組的野生型H5N2亞型AIV(H5N1和H9N2)，是從中國西藏雞群中分離出來的。H5N2亞型AIV重組后在家禽市場中發(fā)生持續(xù)性重組變異，并造成家禽養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。H5N2亞型AIV危害相比高致病性毒株低，主要對(duì)家禽影響體現(xiàn)在產(chǎn)蛋量下降、停蛋、受精困難、雛禽死亡率高及易感大腸桿菌等。

1.3 H5N 6亞型AIV流行情況

H5N6亞型AIV首次出現(xiàn)在我搞四川省南充，作為新型重組AIV，NA基因遺傳于H6N6亞型AIV，還有部分基因遺傳于H5N1亞型AIV[8]。H5N6亞型AIV分為江西系和四川系兩種不同的分系，在江西和四川兩省活禽市場分離出H5N6亞型AIV多的毒株有8株。家禽感染H5N6亞型AIV的后，腎臟、肺、心臟等器官出血，并發(fā)生明顯的病理變化，對(duì)家禽和小鼠致病力和致死率都很高。今年，在我國黑龍江、廣東、云南等省及越南、老撾等地分離出H5N6亞型AIV毒株。由于H5N6亞型AIV HA蛋白160位AA的T突變?yōu)锳，且NA蛋白莖部缺失11個(gè)AA，進(jìn)而使病毒與哺乳動(dòng)物的親和力增強(qiáng)[9]。我國感染人的H5N6亞型AIV同源與四川系。全球感染H5N6亞型AIV的人已有多例，但沒有人傳人的例證。

1.4 H 5N 8亞型AIV流行情況

2014年H5N8亞型AIV爆發(fā)于韓國[10]。隨之臺(tái)灣、日本、英國、荷蘭、德國等發(fā)現(xiàn)H5N8亞型AIV病情，經(jīng)濟(jì)損失巨大。由于H5N8亞型AIV可能與候鳥遷移有關(guān)，所以疫情通常局部爆發(fā)，持續(xù)時(shí)間較短[11]。H5N8亞型AIV感染鴨子不會(huì)致死，感染其他家禽會(huì)致死，感染雪豹毒力很低，尚無感染人的病例[12]。

2 H5亞型禽流感病毒檢測(cè)方法

血清眾多、宿主范圍廣泛、抗原變異性強(qiáng)、感染頻繁的禽流感病毒一直是養(yǎng)禽業(yè)的重大流行疫病[13]。H5高致病性的AIV不但對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且可直接感染人類。所以，快速檢測(cè)H5亞型AIV，是養(yǎng)禽業(yè)正常發(fā)展和人類安全的重要保障。

2.1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)

防控H5亞型AIV的重要措施是及時(shí)檢測(cè)和快速診斷。實(shí)時(shí)定量RT-PCR(RRT-PCR)是檢測(cè)AIV的方法其中之一。還有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，反轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等。研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法具有重復(fù)性好、靈敏度高、快速等特點(diǎn)，適用于快速定量檢測(cè)H5亞型AIV[14]。傳統(tǒng)檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)周期較長和儀器操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確診斷H5亞型AIV。

2.2 LAMP快速檢測(cè)方法

水浴鍋中等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，恒溫條件下完成了核酸變性和自動(dòng)循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增[15]。原理是等溫條件下DNA聚合酶在幾分鐘內(nèi)可大量擴(kuò)增靶基因[16]。LAMP快速檢測(cè)方法適用于基層診斷和篩查病原微生物（H5亞型AIV），具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速及肉眼觀察結(jié)果和儀器設(shè)備便宜等特點(diǎn)。

2.3 RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)

在LAMP快速檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上建立一種可視化快速檢測(cè)H5亞型AIV方法被叫做逆轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)。此方法為控制疫情擴(kuò)散和減少經(jīng)濟(jì)損失取得了寶貴時(shí)間。2013年[17]彭宜等優(yōu)化RT-LAMP檢測(cè)方法，使其操作更加簡便快捷，采用常規(guī)水浴鍋，恒溫加熱50min，便可特異性檢測(cè)H5亞型AIV，靈敏的是常規(guī)RT-PCR的10倍，結(jié)果可根據(jù)反應(yīng)液顏色變化進(jìn)行判定，無需打開反應(yīng)管蓋。同樣，實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(qRT-LAMP)可有效檢測(cè)AIV-H5，靈敏度是國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的100倍，最低可檢測(cè)1個(gè)拷貝基因；該方法沒有交叉反應(yīng)，重復(fù)性較好，特異性較強(qiáng)；可應(yīng)用于小規(guī)模AIV-H5的普查檢測(cè)[18]。還有2016年[19]黃書林等針對(duì)H5亞型AIV血凝素(hemagglutinin，HA)基因的8個(gè)保守區(qū)域進(jìn)行引物擴(kuò)增。并在RT-LAMP反應(yīng)體系中加入優(yōu)選的凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥。此方法比RT-PCR方法敏感10倍左右，并不影響等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的敏感性。采用此方法可特異性檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)和禽流感病毒。此外，建立的H5亞型AIVRT-LAMP反應(yīng)體系便于研制成試劑盒產(chǎn)品，其較高的靈敏性、特異性和簡捷的操作利于養(yǎng)殖場和基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

3 H5亞型AIV疫苗候選株的構(gòu)建及鑒定

HA1和HA2構(gòu)成的血凝素(hemagglutunin，HA)是AIV主要結(jié)構(gòu)蛋白。HA1和HA2亞基的作用分別是識(shí)別細(xì)胞表面受體并與之結(jié)合，和參與病毒及細(xì)胞融合。作為AIV保護(hù)性抗原的HA，可通過細(xì)胞表面的 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)來誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。一些TLR的配體是鞭毛蛋白，如TLR5。由四個(gè)結(jié)構(gòu)域(D0、D1、D2、D3)組成的鞭毛蛋白，是細(xì)菌鞭毛表面絲狀部位的結(jié)構(gòu)蛋白。TLR5可識(shí)別高度保守的D1區(qū)，并產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，今兒激發(fā)佐劑效應(yīng)。研究顯示，可增強(qiáng)雞對(duì)禽流感疫苗粘膜免疫應(yīng)答的沙門氏菌，說明鞭毛蛋白在家禽新型疫苗研制方面潛力很大[20]。還有學(xué)者正確構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET32a-HA1-2-fijB,并成功表達(dá)出融合蛋白HA1-2-fijB，其具有良好免疫反應(yīng)性和TLR5活性，為研制H5亞型AIV新型疫苗提供理論依據(jù)[21]。

2012年[22]張超林針對(duì)禽流感病毒顆粒(Avian Influenza Virus-like particles，AI-VLPs) 進(jìn)行疫苗效力研究。得出AI-VLPs疫苗能誘導(dǎo)BALB/c小鼠和SPF雞內(nèi)的高水平HI抗體和中和抗體，且有效保護(hù)小鼠和雞，免受致死性AIV的攻擊。

2014年[23]王萱等針對(duì)不斷變異的Clade2.3.4 H5亞型AIV潛在引發(fā)地方性流行性傳播，根據(jù)流行檢測(cè)抗原分析結(jié)果制備疫苗候選株。采用反向遺傳操作系統(tǒng)，骨架為A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的內(nèi)部基因，供體為Clade2.3.4 H5N1亞型AIV/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的NA和HA基因，把wt-HB株HA基因中編碼多堿性氨基酸序列刪除，得出1株重組病毒rHB/PR8。病毒rHB/PR8對(duì)雞胚和雞無致病性，但可在雞胚和MDCK細(xì)胞上生長繁殖。上述研究為Clade2.3.4H5亞型AIV的變異防空提供了疫苗候選株。

2016年[24]吳艷濤在HVTFC 126疫苗毒株基因組US2區(qū)選擇一個(gè)合適的位點(diǎn)進(jìn)行插入，拯救了一株重組病毒rHVT-EGFP，其具有能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)。其次，根據(jù)同源重組原理，利用基因組與轉(zhuǎn)運(yùn)載體共然的方法，再用HA基因表達(dá)盒替換重組的病毒基因中的EGFP，成功拯救出rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8 三 株表達(dá)HA基因的重組病毒，且三株重組病毒本省生物學(xué)特性未受到插入外源基因的影響。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)三株重組病毒的免疫效力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，得出HA抗原性相一致的H5亞型AIV能被重組病毒進(jìn)行全面保護(hù)。

4 不同H5亞型AIV疫苗的研究與應(yīng)用

禽流感病毒變異快，血清類型較多，導(dǎo)致防控很困難。到目前為止，沒有防治禽流感的特效方法，主要的預(yù)防措施是接種疫苗，來阻止AIV的發(fā)生與傳播[25]。

現(xiàn)在H5亞型AIV疫苗的類型有滅活疫苗(inactivated vaccine)、亞單位疫苗(subunit vaccine)、重組活載體疫苗 (Recombinant Live Influenza Virus Vaccine)、DNA疫苗及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等。國內(nèi)常用的一般是滅活疫苗和重組活載體疫苗。

4.1 滅活疫苗

禽流感全病毒滅活疫苗是在雞胚囊腔上接種病毒株，待其增殖后，用甲醛滅活后得到。IV的優(yōu)點(diǎn)是免疫效果較好、安全穩(wěn)定、免疫持續(xù)期長及不出現(xiàn)毒力返強(qiáng)等。但免疫計(jì)量大、多次免疫，且不能誘導(dǎo)粘膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[26]。

有研究表明，H5亞型AIV的Re-4+Re-5株滅活疫苗加強(qiáng)免疫后，可讓雞群達(dá)到100%免疫，但鴨群免疫效果不明顯[27]。而單獨(dú)H5亞型AIV的滅活疫苗種毒Re-4免疫合格數(shù)為90%左右[28]。還有H5亞型AIV滅活疫苗種毒Re-6株具有抗原針對(duì)性強(qiáng)、雞胚上可大量增殖，但對(duì)SPF雞及其雞胚沒有致病性[29]。有專家以肉鵝作為研究對(duì)象，進(jìn)行H5亞型AIV滅活疫苗對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水禽用H5亞型AIV滅活疫苗(H5N2亞型D7)和H5N1 Re-6株對(duì)肉鵝都有很好的免疫保護(hù)效果[30]。此外，H5亞型AIV滅活疫苗(H5N2亞型D7)對(duì)21d的SPF鴨HI抗體效價(jià)幾何滴度可達(dá)7.4log2，且較好的免疫保護(hù)集體受到高致病性禽流感病毒的攻擊,且可阻止機(jī)體排毒[31]。

4.2 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是一種重組病毒，是將免疫原性基因?qū)氩《据d體中得到，免疫原性蛋白在動(dòng)物體內(nèi)不斷表達(dá)，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫力。此疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性高、免疫效果好，但外源基因選擇較難。具有較好免疫保護(hù)效果的重組禽痘病毒(fowl pox virus,FPV)表達(dá)了H5N1亞型HA和NA基因。將AIV HA基因插入新城疫的LaSota弱毒株中的禽流感-新城疫二聯(lián)活疫苗，同時(shí)達(dá)到了預(yù)防禽流感和新城疫的效果。

有研究顯示，禽流感-新城疫二聯(lián)活疫苗(rLH5-1)誘導(dǎo)的HI抗體水平為5.13log2，且有補(bǔ)充作用新型基因工程疫苗具有較好的免疫保護(hù)性[32]。但有研究顯示，禽流感-新城疫二聯(lián)活疫苗(H5N1亞型，Re-6株+Re-4株)對(duì)商品肉雞沒有較好的免疫效果，所以需要實(shí)施生物安全措施[33]。

5 小結(jié)

在水禽養(yǎng)殖過程中，如何有效防控禽流感病毒其中重要環(huán)節(jié)之一。因?yàn)榍萘鞲胁《静坏绊懰萁】蛋l(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益，而且威脅到哺乳動(dòng)物及人類健康安全。隨著實(shí)際生產(chǎn)過程中禽流感病毒不斷變異成新型病毒，對(duì)水禽養(yǎng)殖業(yè)疫苗防控和健康安全等方面提出新的要求與挑戰(zhàn)，如何科學(xué)合理的快速、有效防控水禽養(yǎng)殖業(yè)禽流感病毒一直是人類關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

[1]Neumann G, Kawaoka Y. Host range restriction and pathogenicity in the context of influenza pandemic [J]. Emerg Infect Dis,2006,12：881-886.

[2]Kang S M, Song J M, Compans R W. Novel vaccines against influenza viruses [J]. Virus Res, 2011, 162(1-2)： 31-38.

[3]Xu X, Subbarao, Cox N J, et al.Genetic characterization of the pathogenic A/Goose /Guangdong /1 /96 (HSN1) virus： similarity of its hemagglutinin gene to those viruses from the 1997 outbreaks in HongKong}J}. Virology, 1999,261(1)：15-19.

[4]Chen, H. et al. Establishment of multiple sublineages of HSNI influenza virus in Asia：implications for pandemic control. Proc. Natl Acad. Sci.USA,2006,103：2845-2850.

[5]Zhao S, Suo L, Jin M. Genetic characterization of a novel recombinant H5N2 avian influenza virus isolated from chickens in Tibet[J]. Journal of Virology, 2012,86(24)：13836-13837.

[6]Snoeck C J, Adeyanju A T, De Landtsheer S, et al.Reassortant lowpathogenic avian influenza H5N2 viruses in African wild birds [J].Journal of General Virology, 2011,92(Pt 5)：1172-1183.

[7]Zhao G, Gu X, Lu X, et al.Novel reassortant highly pathogenic H5N2 avian influenza viruses in poultry in China[J]. PLoS One, 2012,7(9)：e46183.

[8]Qi X, Cui L, Yu H, et al.Whole-Genome Sequence of a Reassortant H5N6 Avian Influenza Virus Isolated from a Live Poultry Market in China, 2013 [J]. Genome Announc, 2014,2(5).

[9]Bi Y, Mei K, Shi W, et al.Two novel reassortants of avian influenza A (H5N6) virus in China[J].Journal of General Virology, 2015,96(Pt 5)：975-981.

[10]Lee Y J, Kang H M, Lee E K, et al.Novel reassortant influenza A(H5N8) vruses，South Korea [J]. Emerging Infectious Diseases, 2014,20(6)：1087-1089.

[11]Dalby A R, Iqbal M. The European and Japanese outbreaks of H5N8 derive from a single source population providing evidence for the dispersal along the long distance bird migratory flyways [J].Peerj,2015,3：e934.

[12]Pulit-Penaloza J A,Sun X,Creager H M,et al.Pathogenesis and Transmission of Novel Highly Pathogenic Avian Influenza H5N2 and H5N8 Viruses in Ferrets and Mice[J].Journal of Virology,2015,89(20)：10286-10293.

[13]Webster RG,Bean W J,Gorman O T,et al.Evolution and ecology of influenza Airuses[J].Microbiol Rev,1992,56(1)152-179.

[14]呂恒,張錦海,王長軍,等.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)H5亞型禽流感病毒[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,30(06)：398-401.

[15]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,etal.?Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Mucleic Acid Res J,2000,28(12)：e63.

[16]Tomita N,Mori Y,Kanda H et al.Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)of gene sequences and simple visual detection of products[J].Nat Protoc,2008,3(5)：877-882.

[17]彭宜,謝芝勛,劉加波,等.H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)的建立[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,44(02)：323-327.

[18]劉蕓,唐金明,陶虹,等.H5亞型禽流感病毒現(xiàn)場實(shí)時(shí)熒光RTLAMP檢測(cè)方法點(diǎn)的建立與優(yōu)化[J].病毒學(xué)報(bào),2013,29(05)：488-494.

[19]黃書林,吳彤,蔣菲,等.H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,24(09)：1384-1391.

[20]Xiong S,Zheng Y,,Jiang P,et al.Micro RNA-7 inhibits the growth of human non-small cell lung cancer A549 cells through targeting Bcl-2[J].Int JBiol Sci，2011，7(6)：805-816.

S858.31

A

1006-4907（2017）04-0046-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.022

2017-06-30

吳宗耀（1977～），男，助理獸醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事動(dòng)物疾病監(jiān)測(cè)工作，E-mail：2604454625@qq.com。