梁潔玲,王洋洋,司艷輝,李海珠,陳立強

(肇慶市第一人民醫(yī)院,廣東 肇慶 526060)

MicroRNAs(miRNA)是由18-22nt組成的非編碼RNA,其在基因表達過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。隨著序列檢測技術(shù)的提高,對miRNA的研究亦進一步深入,而新穎的miRNA合成技術(shù)開展也加深了我們對miRNA的認識[1]。許多研究機構(gòu)已經(jīng)報道m(xù)iRNA在癌癥、糖尿病、心臟病和自身免疫性疾病中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,而且miRNA在多種體液中存在,包括血漿、血清、尿液、精液和唾液等；對體液miRNA進行檢測可對某些疾病的診斷和藥物治療提供更科學的依據(jù),故miRNA可作為某些疾病的診斷標記物并推廣應(yīng)用[2]。此文針對miRNA調(diào)節(jié)機制及近期檢測方法進行綜述,以了解miRNA的檢測方法的最新進展。

1 miRNA簡介

真核細胞基因表達的傳統(tǒng)中心法則是DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,再由mRNA翻譯為蛋白質(zhì)。自從miRNA被發(fā)現(xiàn),讓我們對RNA的生成和調(diào)控機制有了新的認識。miRNA是微小(21-22nt)的RNA,其功能主要是調(diào)節(jié)基因表達和蛋白質(zhì)的生物合成[3]。miRNA可通過識別mRNA的特定序列,抑制多種類型的mRNA轉(zhuǎn)錄和影響蛋白質(zhì)的合成。通過對miRNA的功能研究發(fā)現(xiàn),miRNA的調(diào)控錯誤會影響多種基因表達,最終導致疾病的發(fā)生。miRNA主要來自其靶基因的基因序列之間或基因內(nèi)區(qū),這類miRNA與靶基因共同轉(zhuǎn)錄,再識別細胞內(nèi)環(huán)境的狀況對靶基因進行調(diào)控,達到細胞內(nèi)環(huán)境平衡[4]。某些miRNA前體是由蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因序列內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)錄生成,或者來源于非蛋白編碼基因RNA的外顯子序列,因此該類miRNA的表達主要作用于其靶基因。另外有部分miRNA主要作用于啟動子序列的多順反子區(qū)域,在miRNA修飾成熟過程中保持多種類型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[5]。

2 miRNA生成與調(diào)控機制

miRNA的生成需要多種蛋白酶,pri-miRNA的剪切須RNAse III Drosha和DGCR8(一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白),這種蛋白復合物是由大約70nt核苷酸組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA,pre-miRNA的3’和5’磷酸末端向外伸展,形成獨特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[6]；這時pre-miRNA通過Exportin-5(一種Ran-GTP依賴蛋白)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。pre-miRNA轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)后通過Dicer(RNAse III蛋白酶)剪切,同時與轉(zhuǎn)運激活反應(yīng)性RNA結(jié)合蛋白(transactivation Response RNA-Binding Protein,TRBP)形成聯(lián)合體[7]。此時pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)會解開并且3’末端會伸出約22nt的RNA雙鏈結(jié)構(gòu),Dicer將此RNA轉(zhuǎn)運至Ago(Argonaute)蛋白并相互結(jié)合,構(gòu)成RNA誘導沉默復合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC)；此時該RISC是前體RISC,要形成成熟的RISC還需進行該RNA雙鏈的分離,該過程稱為RNA的鏈分選過程。RNA的鏈分選過程主要由熱力學因素決定,主要取決于RNA雙鏈的前面4個核苷酸分子。因此,首先末端分離的RNA單鏈作為向?qū)ф溕蒻iRNA復合物,而隨從鏈會被分解處理。細胞質(zhì)中成熟的RISC復合物可尋找與miRNA序列相匹配的mRNA,miRNA與mRNA根據(jù)Watson-Crick法則進行配對結(jié)合,結(jié)合區(qū)域是mRNA的3’未翻譯區(qū)域(untranslated region,UTR ) 與miRNA的“種子序列”(即miRNA第2-8的核苷酸序列)[8]。miRNA不一定都是以DNA序列作為模板,有6%的人體miRNA以RNA作為模板進行編輯。此外,單獨的pre-miRNA可以生成多種成熟的miRNA,每種miRNA序列的長度和核苷酸順序均不相同,該類型的miRNA稱為isomiRNA。這種miRNA的編輯可改變“種子序列”的結(jié)構(gòu),從而改變miRNA與靶向mRNA的識別,此機制講改變miRNA對靶基因的選擇。細胞內(nèi)不同類型的isomiRs表達會影響不同蛋白的表達,miRNA的類型和數(shù)量均能影響該細胞的生理功能,若miRNA的生成以及表達發(fā)生異常,會直接導致細胞和組織的內(nèi)部功能紊亂[9]。沉默mRNA可使mRNA降解或抑制其表達,miRNA與mRNA匹配結(jié)合后,通過Ago酶作用對mRNA進行剪切,而如果miRNA與mRNA不是完全匹配,則會抑制mRNA的表達,對蛋白質(zhì)翻譯的過程產(chǎn)生抑制機制[10]。

3 miRNA檢測

3.1 實時定量PCR測定miRNA

由于miRNA序列較短,難以利用其有效的特異性引物和探針對其進行實時定量PCR檢測,而有些學者利用較長的pre-miRNA作為把序列進行檢測,但pre-miRNA的檢測不能真實反映miRNA的表達水平[11]。現(xiàn)在的解決方法是設(shè)計一種莖環(huán)狀的PCR引物對miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄,然后對cDNA再進行實時定量PCR檢測。RT-PCR引物的設(shè)計有2種類型,一是有Oligod(T)特異的RT引物,該引物包含與miRNA互補序列加上約20個左右的Oligod(T)結(jié)構(gòu)；二是莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT-PCR引物,由可以形成特異性環(huán)莖狀的特異序列的6-8個與miRNA3’端反向互補堿基構(gòu)成,一個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物與一條miRNA序列特異引物相互對應(yīng)。兩種引物各自有其優(yōu)點,Oligod(T)特異的RT引物設(shè)計簡單而且檢測通量高,而莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT-PCR引物的靈敏度和特異性比前者高[12]。

3.2 生物芯片測定miRNA

生物芯片檢測miRNA的技術(shù)路線主要包括了樣品RNA的準備、生物芯片的預處理、芯片的掃描及數(shù)據(jù)讀取和最后的數(shù)據(jù)分析。生物芯片經(jīng)雜交后,數(shù)據(jù)通過熒光檢測設(shè)備檢測熒光的強度,芯片上的每一個雜交點都是單一的miRNA雜交信號,通過設(shè)備精細讀取芯片的信息,可以獲取這些雜交信號的相對表達強弱[13]。隨后將芯片探針類型與數(shù)據(jù)庫探針類型進行同步處理,讀取雜交的信號進行預處理,各個探針的表達水平形成數(shù)據(jù)再與特定基因的表達進行背景校正,多種樣品進行比較和數(shù)據(jù)整合,最終得到miRNA的相對表達量。通過不同的實驗設(shè)計與多樣的統(tǒng)計手段,可做反映miRNA或者甲基化的區(qū)域的相關(guān)研究。隨著miRNA芯片技術(shù)的發(fā)展,可進行miRNA靶基因的預測,或利用分析軟件對相關(guān)基因進行功能分析；根據(jù)數(shù)據(jù)庫信息整合,發(fā)現(xiàn)新的生物信號和代謝通路。因此,大數(shù)據(jù)庫的整合利用可完成miRNA-miRNA表達相關(guān)性分析,miRNA-靶mRNA表達相關(guān)性分析和對miRNA功能推導,從而得到異常miRNA參與的生物學過程[14]。

4 結(jié)語

綜上所述,miRNA對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控產(chǎn)生重要的調(diào)控作用,miRNA與mRNA結(jié)合而抑制其翻譯過程。研究發(fā)現(xiàn)大部分病理過程均出現(xiàn)miRNA表達異常,故miRNA可作為某些疾病的標志物進行檢測,更深入的研究miRNA的功能和特征、檢測方法的更新為其作為診斷手段提供更合理的素材。因此,miRNA可作為疾病診斷和預測的新的標志物,而診斷標準和診斷數(shù)據(jù)的整合,標本的處理和保存,技術(shù)流程的規(guī)范對miRNA成為診斷標志物至關(guān)重要。

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