孫繼紅 萬大國 張衛(wèi)國 張娟

鄭州大學第二附屬醫(yī)院 鄭州 450000

風濕性心臟病患者左心耳組織中自噬相關蛋白與房顫的相關研究

孫繼紅 萬大國 張衛(wèi)國 張娟

鄭州大學第二附屬醫(yī)院 鄭州 450000

目的通過風濕性心臟病(風心病)患者左心耳組織中自噬相關基因的檢測，探討其與風心病房顫的可能關系。方法將59例風心病患者分為竇律組(28例)和房顫組(31例)，應用q-PCR檢測自噬相關蛋白Beclin-1和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)mRNA水平，同時用Western blot技術檢測相應蛋白的表達水平,采用Pearson相關分析上述指標與風心病患者左心房內徑的相關性。結果房顫組mRNA表達Beclin-1為(3.94±1.07)、LC3Ⅱ為(4.06±0.94)，分別高于竇律組的(1.83±0.54)和(2.37±0.67)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。房顫組相應蛋白表達Beclin-1為(1.49±0.31)、LC3Ⅱ為(1.84±0.37)，分別高于竇律組的(0.53±0.11)和(0.93±0.10),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論風心病房顫患者左心耳自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達增加，可能與風心病房顫的發(fā)生發(fā)展相關。

自噬；風濕性心臟??；房顫；Beclin-1；LC3

目前全世界大約有6800萬風濕性心臟病(風心病)患者，每年約造成140萬人死亡[1]。我國心臟外科患者中風心病約占30%[2]，其中房顫是風心病患者最常見的致死和致殘原因之一。目前對于房顫的發(fā)生發(fā)展機制尚不明確，學術界公認心房電重構、結構重構和神經(jīng)傳導重構都對房顫的發(fā)生和維持起著極其重要的作用。結構重構是一種適應性的改變，包括心肌細胞自噬、溶解、變性及凋亡。這些適應性的形態(tài)改變影響了心房肌細胞內的信號轉導和心肌收縮力，比電生理結構的改變更易導致房顫。

自噬是細胞通過自我降解衰老的或損壞的組織、蛋白及細胞器，完成細胞自我更新及物質重復利用的過程。自噬水平過低與過高都會影響心肌穩(wěn)態(tài)。自噬相關蛋白Beclin-1是啟動自噬的關鍵分子，自噬發(fā)生時，自噬相關蛋白LC3 Ⅰ不斷向LC3 Ⅱ轉變，在形成自噬小體外膜的過程中起重要作用。因此Beclin-1和LC3 Ⅱ被認為是自噬發(fā)生的標志。Yuan Y[3]等指出房顫的潛在致病因素之一是自噬水平的失衡，目前有關自噬在風心病伴房顫的表達研究尚很少，本研究旨在探討房顫的發(fā)生是否與自噬相關，為今后臨床風心病的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015-01—2016-04間在鄭州大學二附院心血管外科行瓣膜置換術的患者59例。男24例，女35例；年齡44～68歲，平均53.1歲。根據(jù)患者癥狀、體征、心電圖及心臟彩超檢查明確是否合并房顫，將59例患者分為竇律組(28例)和房顫組(31例)。

1.2方法

1.2.1 標本采集 在患者行體外循環(huán)下瓣膜置換術中取其左心耳組織，樣本采集后立刻液氮冷凍存儲，以備后續(xù)實驗實用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 研缽研磨組織后提取左心耳組織總RNA，后-80℃?zhèn)溆?。按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。

1.2.3 q-PCR 按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行反應，采用相對定量，按2-△△CT法進行定量及判斷是否表達上調。

1.2.4 Western blot檢測自噬相關蛋白表達 加入蛋白裂解液裂解組織，提取蛋白放-80℃?zhèn)溆?，Western blot檢測自噬相關蛋白表達，對Western blot結果的灰度值進行數(shù)據(jù)分析,以待測條帶的灰度值與GAPDH的比值表示各組相應蛋白的表達強度，LC3 Ⅱ灰度值與LC3 I灰度值相比后所得結果數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 mRNA表達房顫組mRNA表達Beclin-1為(3.94±1.07)、LC3Ⅱ為(4.06±0.94)，竇律組分別為(1.83±0.54)和(2.37±0.67)。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2蛋白表達房顫組蛋白表達Beclin-1為(1.49±0.31)、LC3 Ⅱ為(1.84±0.37),竇律組分別為(0.53±0.11)和(0.93±0.10)。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

目前對于房顫的發(fā)生發(fā)展機制仍不十分明確。近年來，自噬作為另外一種死亡方式，引起了醫(yī)學界的普遍關注。自噬是細胞內批量降解長壽命蛋白和細胞器的生物學過程，細胞內受損細胞器以及蛋白聚集體幾乎全部經(jīng)自噬途徑降解。因此，自噬可使細胞維持自我更新，在保持細胞器正常功能、蛋白質表達及細胞結構方面發(fā)揮重要作用[4]。

在心血管系統(tǒng)，生理水平的自噬對于維持心臟穩(wěn)態(tài)和心臟功能具有重要作用。大量研究表明，多數(shù)病理性自噬均參與心血管系統(tǒng)的損傷，如冠心病、瓣膜病、高血壓、心臟缺血再灌注、慢性心力衰竭等。而有關自噬與風心病房顫的研究尚在起步階段，本研究的目的是進一步探討左心耳組織自體吞噬與風心病房顫的關系。

LC3是一種自噬相關蛋白，生理情況下，胞漿中LC3合成后即被加工生成LC3Ⅰ，而當自噬被激活時，LC3Ⅰ則會轉變?yōu)長C3Ⅱ。我們可以通過LC3Ⅱ的表達量反應自噬的強度。Beclin-1也是一種自噬相關蛋白，它在自噬初期階段負責膜的成核作用，其表達隨自噬增強而升高。宋揚等[5]在16例風心病患者中發(fā)現(xiàn)，Beclin-1 mRNA異常增高，可能與風心病房顫的發(fā)生相關。本研究發(fā)現(xiàn)在風心病合并房顫患者的左心耳組織中，Beclin-1和LC3Ⅱ的基因與蛋白表達水平顯著增加，與竇性心律組有顯著性差異，進而推測自噬有可能參與了風心病患者房顫的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，我們的研究揭示了自噬在風心病房顫患者的左心耳組織中增強，可能在其發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調控作用。

[1] Farrar EJ, Butcher JT. Valvular heart disease in the developing world:developmental biology takes center stage[J]. J Heart Valve Dis,2012,21(2):234-240.

[2] 劉文洲,孫宇,王俊龍,等.二尖瓣狹窄合并心房顫動患者HCN2表達與測序[J].臨床心血管雜志,2014,30(1):56-57.

[3] Yuan Y, Zhao Yan, Yan S, et al. Autop 770. hagy: a potential novel mechanistic contributor to atrial fibrillation[J].International journal of cardiology, 2014,Mar;172(2):492-4.

[4] Carloni S,Albertini M C,Galluzzi L,et al.Increased autophagy reduces endoplasmic reticulum stress after neonatal hypoxia-ischemia:Role of protein synthesis and autophagic pathways[J].Exp Neurol,2014.

[5] 宋揚，秦青，高菊榮.自噬相關蛋白Beclin 1在風濕性心臟病中的作用研究[J].西北國防醫(yī)學雜志，2016,37(2):78-80.

R514.7+5

A

1077-8991(2017)06-0013-02

(收稿 2017-08-31)