謝 強(qiáng), 王 坤, 陶家林

(1. 四川大學(xué) 生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；2. 中國(guó)科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)有限公司，四川 成都 610041)

·研究簡(jiǎn)報(bào)·

熊去氧膽酸生產(chǎn)中相關(guān)物質(zhì)的分析

謝 強(qiáng)1,2, 王 坤2, 陶家林2

(1. 四川大學(xué) 生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；2. 中國(guó)科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)有限公司，四川 成都 610041)

建立了HPLC-示差折光檢測(cè)器外標(biāo)法測(cè)定熊去氧膽酸中4種特殊雜質(zhì)及其他有關(guān)物質(zhì)含量的方法，結(jié)果表明各樣品在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 1～0.999 6)，方法回收率、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求，適用于熊去氧膽酸生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

熊去氧膽酸; 鵝去氧膽酸; 7-酮基石膽酸; 高效液相法; 示差檢測(cè)器; 分析

熊去氧膽酸(UDCA)是名貴中藥熊膽的主要有效成分，主要用于膽結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎、病毒性肝炎等多種膽汁淤積性肝病的治療，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的唯一藥物[1-3]。該藥物同時(shí)也是唯一用于肝臟移植術(shù)中提高手術(shù)成活率的藥物，屬于消化內(nèi)科重要的臨床治療藥物。

目前熊去氧膽酸的制備主要采用鵝去氧膽酸(CDCA)化學(xué)合成，在生產(chǎn)和貯存過程中主要有以下雜質(zhì)：7-酮基膽石酸(7K-LCA)、膽酸(CA)和膽石酸(LCA)(Chart 1)[4-5]。研究結(jié)果表明雜質(zhì)成分如膽石酸可能引起一些不良反應(yīng)[6]。因此對(duì)熊去氧膽酸的質(zhì)量控制在安全用藥上顯得尤為重要。當(dāng)前關(guān)于熊去氧膽酸的分析,主要有TLC法、氣相色譜法和HPLC法?！吨袊?guó)藥典》2015年版中采用酸堿滴定法測(cè)定熊去氧膽酸含量，對(duì)有關(guān)物質(zhì)采用薄層色譜法檢測(cè)，專屬性和靈敏度有一定局限性[7-9]。相關(guān)文獻(xiàn)中采用HPLC-UV法，但熊去氧膽酸等膽酸類組分紫外吸收較弱，最大吸收波長(zhǎng)均處于末端吸收[10-11]。

Chart 1

為了有效檢出熊去氧膽酸中的相關(guān)雜質(zhì)，更好地控制其質(zhì)量，本文建立了熊去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的HPLC-RID法，能同時(shí)測(cè)定熊去氧膽酸中4種特殊雜質(zhì)及其他有關(guān)物質(zhì)含量，該法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于熊去氧膽酸的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

日本島津LC-20AD型高相液相色譜儀；島津RID-20A型示差檢測(cè)器；Anlais3010型工作站。

膽酸(98%)和膽石酸(98%)，麥卡希試劑；7-酮基石膽酸(98.5%)，自制；鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；熊去氧膽酸樣品由中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司大邑分公司提供，批號(hào)：UD-151224、151226、151230；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸氫二鈉和磷酸為分析純。

1.2 分析方法

(1) 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動(dòng)相:0.02 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)/甲醇/乙腈(30/40/30)，流速：1 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 uL。按外標(biāo)法計(jì)算供試品中已知雜質(zhì)含量，以熊去氧膽酸的峰面積計(jì)算其他未知雜質(zhì)含量。

(2) 溶液配制

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、7-酮基石膽酸、膽石酸對(duì)照品，用甲醇溶解，用流動(dòng)相配成含熊去氧膽酸4 mg·mL-1、鵝去氧膽酸2 mg·mL-1、膽酸1 mg·mL-1、7-酮基石膽酸1 mg·mL-1、膽石酸0.5 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品貯備液。精密量取貯備液各1 mL，用流動(dòng)相定容至10 mL，作為對(duì)照品溶液。

樣品溶液的配制：取樣品適量，用甲醇溶解，用流動(dòng)相稀釋為40 mg·mL-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性

取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖2)，系統(tǒng)適用性結(jié)果見表1。從表1可以看出，各樣品的分離度均1.5，符合藥典基線分離要求，且極性最弱的膽石酸出峰時(shí)間較快，總分析時(shí)間不超過15 min，系統(tǒng)適用性好。

Time/min圖2 對(duì)照品的高效液相色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of standard表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果Table 1 Results of system suitability

組分保留時(shí)間理論塔板數(shù)分離度熊去氧膽酸5.6006396膽酸6.52577543.2187-酮基膽石酸7.07082161.796鵝去氧膽酸8.62279704.456膽石酸12.85786689.047

2.2 線性范圍和檢測(cè)線

分別精密量取對(duì)照品貯備液，分別用甲醇溶解制成一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(熊去氧膽酸：0.1, 0.3, 0.6, 1.0, 2.0 mg·mL-1；膽酸： 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1；7-酮基膽石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1)；鵝去氧膽酸：0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80 mg·mL-1；膽石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1，按質(zhì)量濃度由低到高分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積以濃度x(mg·mL-1)對(duì)峰面積y作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸得到線性方程，結(jié)果見表2。由表2可見，各組分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合定量要求。

表2 熊去氧膽酸及相關(guān)雜質(zhì)的回歸方程和檢測(cè)范圍Table 2 Linear functions and detection limits of ursodeoxycholic acid and its related substances

2.3 精密度

在上述色譜條件下，取各組分對(duì)照品溶液20 uL，重復(fù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測(cè)試。熊去氧膽酸 、7-酮基膽石酸、鵝去氧膽酸、膽酸及膽石酸峰面積RSD分別為0.32%， 1.31%， 0.76%， 1.15 %， 1.05%(n=5)，說明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性

精密稱取熊去氧膽酸樣品(UDCA-151224) 5份,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,5次重復(fù)測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可看出該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repeated tests

2.5 穩(wěn)定性

精密吸取供試品溶液,在0, 2, 4, 6, 8 h 按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,峰面積 RSD分別為1.6%, 1.1%, 1.2%和1.3%,表明8 h內(nèi)樣品各成分穩(wěn)定性良好。

2.6 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

對(duì)3批樣品(UD-151224、UD-151226、UD-151230)分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。由表4可以看出，這三批樣品中均未檢出膽酸和膽石酸，主要雜質(zhì)為鵝去氧膽酸和7-酮基膽石酸，其他未知雜質(zhì)含量均小于2.5‰，符合歐洲藥典EP6.0要求，其中UD-151230的最大單個(gè)雜質(zhì)小于0.1‰，符合歐洲藥典EP7.0要求。

表4 熊去氧膽酸中各有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果(%)*Table 4 The detection results of related substances(%)

*-表示未檢出；a其他最大單個(gè)雜質(zhì)

參照《中華人民共和國(guó)藥典》(二部)中記載的方法及相關(guān)文獻(xiàn)，建立了一種能同時(shí)測(cè)定熊去氧膽酸中主要成分熊去氧膽酸以及主要雜質(zhì)鵝去氧膽酸、7-酮基石膽酸、膽酸和膽石酸的含量的HPLC-RID方法。方法回收率、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求，適用于熊去氧膽酸生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

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Analysis of Related Substances in The Production of Ursodeoxycholic Acid

XIE Qiang1,2, WANG Kun2, TAO Jia-lin2*

(1. State Key Laboratory of Biotechnology, Sichuan University， Chengdu 610041, China 2. Chengdu Organic Chemicals Co., LTD., Chinese Academy of Sciences， Chengdu 610041, China)

A HPLC-refractive index detector method for determination of four special substances and other substances in the production of Ursodeoxycholic acid was established. Determination of the impurity possesses good linearity(r=0.999 1～0.999 6), and the method of recovery, precision, stability and repeatability meet standards. The method is suitable for the quality control of Ursodeoxycholic acid production.

Ursodeoxycholic acid; Chenodeoxycholic acid; 7-ketolithocholic acid; high performance liquid chromatography; refractive index detector; analysis

2016-11-01

謝強(qiáng)(1986-)，男,漢族，四川彭州人，助理研究員，主要從事膽酸類化合物的提取分離及結(jié)構(gòu)改造等研究。E-mail:vvxq@hotmail.com

陶家林，研究員， Tel. 028-85217603, E-mail： jialint@cioc.ac.cn

O657.7; O629.22

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16279